芒果叶中芒果苷含量的测定 高效液相色谱法

ICS 65.020.01ICS 65020.30B43 GB中华人民共和国国家标准 GB/T XXX-XXXIGB/XX XXXXXX芒果叶中芒果苷含量的测定 高效液相色谱法Determination of mangiferin in mango (Mangifera indica L.) leaves high-performance liquid chromatorgraphyXXX-XX-XX发布 XXX-XX-XX实施中华人民共和国标准化管理委员会 发 布前言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由中国热带农业科学院提出。本标准由中国标准化研究院归口。本标准起草单位：中国热带农业科学院分析测试中心，中国标准化研究院。本标准主要起草人：阳辛凤，兰韬，席兴军，韩丙军，赵方方，张月，郭晓杰，王盼 1 范围本标准规定了用高效液相色谱-质谱法测定芒果叶中芒果苷含量的原理、材料、仪器与设备、测定步骤、结果计算与表示、精密度和回收率、检验报告。本标准适用于芒果叶中芒果苷含量的测定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 8855 水果和蔬菜 取样方法3 原理样品经提取后，将提取液过滤，经反向高效液相色谱分离测定，在258nm下检测，根据保留时间定性，外标峰面积定量。4 试剂与材料4.1 试剂4.1.1 甲醇（CH3OH）：色谱纯。4.1.2 乙腈（CH3CN）：色谱纯。4.1.3 甲酸（HCOOH）：色谱纯。4.1.4 甲醇溶液（70%）：甲醇与超纯水按照7:3体积比混合。4.1.5 甲酸溶液（0.1%）：1 L超纯水中加入1 mL甲酸。4.1.6 芒果苷（mangiferin，C19H18O11，CAS : 4773-96-0）对照品：纯度98%。4.1.8 流动相：乙腈（4.2）：甲酸溶液（4.5）=15:85（体积比）。4.1.9 芒果苷标准储备溶液（200 g/mL）：称取10 mg（精确至0.10mg）芒果苷对照品，置于50 mL容量瓶中，加甲醇（4.1）超声溶解并定容至刻度线，混匀，配制成200 g/mL的标准储备溶液，18冰箱避光保存，有效期3个月。4.1.10 芒果苷中间浓度标准溶液：准确移取0.5mL芒果苷标准储备溶液于10mL容量瓶中，用甲醇溶液（4.1）稀释至定容刻度线，摇匀，得到芒果苷中间浓度标准溶液（质量浓度10 g/mL）。18冰箱避光保存，有效期1个月。4.1.11 芒果苷系列标准工作液：分别准确移取0.1mL、0.2mL、0.5mL、1mL、2mL芒果苷中间浓度标准溶液于不同的10mL容量瓶中，用70%甲醇溶液（4.4）稀释、定容刻度线，摇匀，得到芒果苷系列标准工作溶液（质量浓度分别为0.1g/mL、0.2g/mL、0.5g/mL、1.0g/mL、2.0g/mL）。28C保存，有效期2周。4.1.12 除另外有规定外，所用试剂均为分析纯，水应复合GB/T6682中一级水的要求。4.2.材料4.2.1 离心管：100 mL（螺旋盖）。4.2.2 三角瓶：250 mL（磨口塞）。4.2.3 容量瓶：10 mL，50 mL，100 mL，250 mL。4.2.4 刻度玻璃移液管：1m mL4.2.5针式微孔滤器：孔径0.22 m，直径13 mm的聚四氟乙烯（PTFE）滤膜或者相当者。5 仪器和设备5.1 液相色谱仪：配紫外（UV）检测器或PDA、DAD检测器。5.2分析天平：感量0.1 mg。5.3电子天平：感量0.01 g。5.4超声波振荡器：功率不低于250 W，或相当的设备。5.5组织捣碎机5.6高速组织匀浆机5.7涡旋振荡器6 测定步骤6.1 试样制备、保存按照GB/T 8855 水果和蔬菜取样方法。新鲜芒果叶片充分打碎（5.5）、混匀，置于洁净容器中，密封并做好标记，于18冰箱避光保存。6.2 提取芒果叶试样（6.1）解冻，称取芒果叶试样1.00g (精确至0.01g) ，置于100 mL离心管（4.2.1）中，加入提取溶剂70%甲醇溶液（4.1.4）50mL，18 000 rpm高速匀浆1 min（5.6），将样品转移到250 mL具塞磨口三角瓶（4.2.2）中。分别用40mL、30mL提取溶剂洗涤离心管和刀头共2次，溶液均合并至三角瓶中。将三角瓶瓶塞盖上，放入超声清洗仪（5.4）中，室温下超声提取30 min。取出，静置20min，使分层。将上清转入250 mL容量瓶中（4.2.3），样品碎渣保留在三角瓶中。三角瓶中加入70%甲醇溶液（4.1.4）100mL，超声30 min，进行二次提取。容量瓶上放置漏斗，放入脱脂棉，将提取液过滤，滤液合并至250mL容量瓶，用少量70%甲醇溶液（4.1.4）洗涤三角瓶内壁与漏斗内壁共3次，洗涤液均合并至250mL容量瓶，静置，样品温度冷却至室温后，用70%甲醇溶液（4.1.4）定容至250mL，摇匀，得到芒果叶样品提取液。以1.0 mL刻度玻璃移液管（4.2.4）吸取样品提取液1.0mL，放入100mL容量瓶中，用70%甲醇溶液（4.1.4）定容，摇匀。用一次性注射器吸取适量体积样品溶液，0.22 m 滤膜过滤（4.2.5），滤液待上机分析。6.3 样品测定6.3.1高效液相色谱参考条件-液相色谱柱：C18色谱柱,柱长250mm,内径4.6mm,粒径5m，或具有同等性能的色谱柱。-流动相：0.1%甲酸溶液（4.5）+乙腈=85+15（体积比）。-流速：1 mL/min。-检测波长：258 nm。-进样体积：10 L。-柱温：25。6.3.2 液相色谱测定分别取适量的芒果苷系列标准工作溶液（4.1.11）及待上机试样溶液，按照6.3.1列出的条件进行液相色谱分析测定。由保留时间进行定性，根据标准工作溶液及芒果苷响应信号，建立标准工作曲线。工作曲线线性相关系数R20.999。待测样液中芒果苷的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进行分析。分析过程中，每20次样品测定后应加入一个与样品峰面积相近的标准工作液，如果测得的值与原值相对平均偏差超过5%，则应重新进行标准曲线的制作。标注曲线及典型样品色谱图参见附录A。7空白试验除不加试样外,均按上述步骤进行。8 结果计算与表示8.1 结果计算试样中目标物的含量按式(1)计算,计算结果需扣除空白值:(0 )V nm 1 0001 000X = 100 （1）式中:X 试样中芒果苷的含量,单位为克每百克(mg/100mg); 样液中芒果苷的浓度,单位为微克每毫升(g/mL);0 空白中芒果苷的浓度,单位为微克每毫升(g/mL);V样液定容体积,单位为毫升(mL);n稀释倍数;m试样的质量,单位为克(g);1000换算系数;100 换算系数。8.2 结果表示测定结果以平均测定的算术平均值表示，计算结果保留两位有效数字。两次平行测定结果的相对平均偏差不应超过5%。9精密度和回收率本方法的精密度和回收率实验结果参见附录B。10检出限当称样量为1g时，芒果苷检出限为 0.08 mg/g，定量限为 0.25 mg/g。11检验报告检验报告应包括以下内容：识别被测试样需要的所有信息；依据本标准方法（本标准编号）；芒果苷的测定结果；实验日期；测定人员。此外，还需说明使用的方法，还应包括本标准未规定的或选择顶的条件，以及可能影响结果的其他条件。测试报告应包括试样的唯一性资料。附 录 A色 谱 图芒果苷标准物质的紫外检测色谱图见图 A.1。a图 A.1 芒果苷对照品紫外检测色谱图（1g/mL）附录B方法的精密度和回收率表1 方法的精密度和回收率样品添加水平（mg/g）重复测定值（mg/g）平均值（mg/g）回收率(%)平均回收率(%)相对标准偏差RSD(%)溶剂空白-0.000.00-芒果叶基质（本底）120.4820.80-220.63-320.60-420.98-521.13-620.63-720.75-820.63-921.18-1021.05-芒果叶2.50122.8823.2583.0098.109.74 223.2397.00323.35102.00423.2397.00523.0088.00623.40104.00723.45106.00823.1895.00923.45106.001023.38103.00芒果叶5.00125.0825.0685.5085.107.31 225.2589.00325.1587.00425.3891.50524.4873.50624.7879.50725.4392.50824.9382.50924.7879.501025.3390.50芒果叶7.50127.3027.3586.6796.357.37 226.8380.33327.8594.00427.8894.33527.6090.67626.8380.33727.4088.00828.2098.67927.0082.671026.6077.33