牛病毒性腹泻与粘膜病.ppt

牛病毒性腹泻与黏膜病 牛病毒性腹泻 又称牛病毒性腹泻 粘膜病 是由BVDV引起的 主要侵害牛 羊 鹿 牦牛等反刍动物及猪的一种重要传染病 临床主要表现为发热 粘膜糜烂 溃疡 白细胞减少 持续感染 咳嗽及怀孕母牛流产或产生畸形胎儿 同一种病原引起的多种病状的传染病我国1980年李佑民首从国外进口奶牛分离出BVDV 上世纪90年代郑志刚等在全国范围内调查 BVDV平均阳性率为19 56 近年来本病在国内阳性检出率呈逐年上涨的趋势 本病给养牛业造成明显损失 产乳 重 流产等 牛病毒性腹泻 BVDV的流行病学 BVDV的病原学 BVDV的基因结构及其蛋白 BVDV的研究进展 内容摘要 BVDV的防治 BVDV的主要诊断方法 BVDV的流行病学 传染源 病牛和带毒牛是主要传染源 传播途径 主要通过消化道和呼吸道传播 直接或间接接触也可以传播 吸血昆虫也是重要的传播媒介 易感动物 主要感染牛 肉牛 奶牛 也可感染猪 本病多发于寒冷季节 过分拥挤可促进本病发生 BVDV的病原学 属黄病毒科 瘟病毒属有囊膜 直径25 30nm 正链RNA胎牛肾 睾丸 猪肾 胎羊睾丸可增殖传代BVDV BVDV可以分成致细胞病变型 CP 和非致细胞病变型 NCP BVDV的基因结构及其蛋白 5 Npro P20 C P14 Erns gp48 E1 gp25 E2 gp53 P7 NS2 3 P125 NS4A P10 NS4B P30 NS5A P58 NS5B P75 3 其中C ERNS E1 E2是病毒的结构蛋白 其余为非结构蛋白 BVDV的主要基因 蛋白研究进展 核衣壳组成成分 具有免疫原性 BVDV基因组具有较高的保守性 瘟病毒属内高度保守 在病毒复制 病毒RNA转译或者病毒多聚蛋白加工过程中具有重要作用 5 UTR C NS3 ERNS 内有一高度保守结构域 可用于研究亚单位疫苗 也可作为基因工程诊断抗原 E2 与抗BVDV抗体结合 介导免疫中和反应及与宿主细胞识别 吸附的主要部位 Npro 具有自体蛋白酶活性 有较高的保守 可以对瘟病毒进行种 群或型的鉴定 5 UTR 5 末端无甲基化的 帽子 结构 5 UTR序列在BVDV的各毒株间有较高的保守性 因此常根据5 UTR的序列设计引物来检测BVDV或对BVDV进行分型 5 UTR在病毒转录 翻译过程中起重要的作用 2010年张兴娟等分别用5 UTR设计一对引物 预扩增片段125bp 2010年孟雨等人也利用5 UTR设计一对引物 预扩增片段218bp 实验证明利用5 UTR设计引物具有很好的特异性和敏感性 E2 是BVDV的主要保护性抗原 能诱导机体产生中和抗体 所以新型疫苗都是针对E2结构蛋白的 也是与抗BVDV抗体结合 介导免疫中和反应及与宿主细胞识别 吸附的主要部位 E2基因一直是国内外学者研究瘟病毒的重点 E2是形成BVD基因工程疫苗的最好的选择 BVDVE2DNA疫苗是近年来BVDV免疫研究的热点 如2007吴明福等构建真核表达质粒pcDNA3 1 E2并免疫小鼠 可诱导小鼠产生一定程度的体液和细胞免疫应答 NS 3 NS3区域与病毒的毒力 生长特性有关 NS3在瘟病毒属内高度保守 在病毒复制 病毒RNA转译或者病毒多聚蛋白加工过程中具有重要作用 NS3的表达与宿主细胞CPE的产生有密切关系 2009年魏伟等用BVDVNS3蛋白中有免疫反应性的重组片段作为包被抗原 建立了一个BVDV抗体检测的间接ELISA方法 血清学诊断 免疫学诊断 诊断方法的进展 分子生物学诊断 1 2 3 血清学诊断 常见的方法为主要包括血清中和试验和琼脂扩散试验两种 琼脂扩散试验准确性较低 检出的结果常常有假阳性 血清中和试验重复性高 准确性好 已作为BVDV诊断的 金标准 但血清中和试验在基层使用时 常遇到费时 费力 需要细胞培养等试验室技术问题 无法得到推广 免疫学诊断 免疫荧光技术 IFA 免疫过氧化物酶技术 IP 免疫荧光技术 IFA 免疫荧光技术 IFA 又称荧光抗体技术 可用于检测细胞培养物以及病变组织的冰冻切片中BVDV感染情况 免疫荧光抗体技术特异 敏感 快速 但它需要荧光显微镜 使得此技术无法得到推广应用 ELISA ELISA常被用于检测组织器官培养物中BVDV 监测牛群中BVD抗体水平 评估潜伏感染情况 其中最常用的是双抗夹心ELISA和间接ELISA 也有使用BVDV单克隆抗体与ELISA联合诊断BVD 研究较多的IBRV诊断蛋白有NS3 E2蛋白 酶联免疫吸附试验 ELISA 免疫过氧化物酶技术 IP 诊断BVDV准确 可靠 可用于了解BVD的总体分布情况 链酶亲和素 生物素过氧化物酶检测方法 可以用来检测福尔马林固定 石蜡包埋组织切片中的BVDV 近年来 为了避免非特异性染色反应 则可以使用单克隆抗体 生物素化抗鼠抗体 链酶亲和素过氧化物酶检测方法 免疫过氧化物酶技术 IP 分子生物学诊断 RT PCR 核酸探针检测 1 2 RT PCR RT PCR是目前广泛应用的分子生物学技术 对于检测BVDV的RNA是一个合适的方法 根据BVDV基因组序列合成一对或几对特异性引物 可以高度特异 敏感的检测出器官 组织 细胞培养物中的BVDV 并可区别CSFV BDV 还可对BVDV的基因型和生物型作进一步的鉴定 PCR引物多数选在BVDV保守区5 UTR和NS3基因内 尤其5 UTR是BVDV进行鉴定 基因分型的首选区域 2007年王伟利建立了BVDV荧光RT PCR检测方法并进行了初步应用 2007年国家质量监督检验检疫局制定了牛病毒性腹泻 黏膜病反转录聚合酶链反应操作规程 核酸探针检测 NAH 与传统方法相比 该技术敏感 特异性强 而且应用很广泛 NAH可直接检测脏器组织和血细胞中的BVDV NAH技术应用最广泛的是核酸标记法 按核酸探针标记物不同可分为两类 一类是放射性同位素 如32P 35S 标记的DNA探针 另一类是用如地高辛 生物素标记的DNA探针 核酸探针技术标记简单 特异性好 可长期保存 并且可以回收利用 制成试剂盒 是一种安全 快速 经济的诊断方法 预防和控制 免疫预防和药物治疗健全完善BVD检测体系 加强检测牛群及牛源生物制品的BVDV污染情况排除掉持续性感染牛等隐性感染动物加强环境监控 在饲养环节加强管理 建立封闭式牧场管理系统 不进行混合饲养实施免疫预防 过度到捕杀根除程序 ThankYou