药物跨膜转运载体

药物跨膜转运载体 ABC类载体 一 ABC类转运体ATP结合盒 ATP bindingcassette ABC 类物质外排转运载体 这类转载体转运各种类型的底物如糖 氨基酸 金属离子 多肽 蛋白质以及各种脂溶性物质外排式跨膜转运 ABC类载体是许多生命过程必须的 缺陷可以引起多种疾病或与多种疾病有关如囊性纤维化 神经系统疾病 视网膜变性 胆固醇和胆汁转运缺失 贫血症和药物反应异常等 特点 1 与ATP结合 利用ATP跨膜转运物质 底物分子转运是单向的 通常是泵出细胞外 2 结构上 ATP 结合域 称之为核苷结合包 NBF 和跨膜 TM 域 该域一般由6个 螺旋段组成 NBF含3个保守区域WalkerA WalkerB和WalkerC 在WalkerA和B存在ATP结合点 而WalkerC为一签名区 位于WalkerB的上游 C区是相应ABC载体特有性的 3 典型的ABC载体有两个NBF和两个TM域 NBF存在于胞浆侧 发现48个ABC载体 这些基因根据区域的构成和氨基酸的同组关系分成7个亚型 许多ABC载体在脂质层的功能维持 脂肪酸转运和类固醇类转运方面有重要的作用 已发现14种与人类疾病相关的ABC基因 ABCC2 Abcc2 基因突变 与Dubin Johnson综合征有关 ABCC2蛋白存在于肝细胞的管侧面膜上调节有机阴离子转运 在多有机阴离子转运载体 TR 的缺陷的大鼠中 该大鼠已用作Dubin Johnson综合征的动物模型 ABCB7基因的错义与成高铁红细胞贫血症和失调 XLSA A 相关 CFTR蛋白为氯离子通道 与所有外分泌有关 缺陷导致胆囊纤维病变 ABCC8是磺酰脲受体 对磺酰脲药物有高度的亲和力 磺酰脲类药物为治疗非胰岛素依赖性糖尿病 主要促进胰岛素的分泌 ABCC8基因突变可能typeII糖尿病有关 二 多药耐药 药物外排载体 所有ABC的外排在体均存在于细胞膜上 参与各种结构类型的药物 代谢物和化合物的外排 根据结构类型 药物外排载体分为四大类 ABC家族药物转运载体的预测二级结构 NBD ATP 核苷结合点 IN 细胞内 OUT细胞外 药物载体在极性细胞 包括组织内皮或上皮细胞 中的定位 1 MDR1P 糖蛋白 MDR1P glycoprotein ABCB1 又称为MDR1 P GP或PGY1 人 MDR1 MDR3 药物 药物 脂质 MDR基因 MDR基因 Mdr1a mdr1b mdr2 药物 药物 脂质 P GP有两个相似和对称的半载体组成 每个半载体有一个ATP结合点和6个TM域 两个半载体只有43 氨基酸序列是一致的 先与ATP结合 再水解是药物转运必需的 不同的底物转运需要的ATP分子是不同的 每转运一个药物分子出细胞 需要0 3 3个分子的ATP P gp催化循环 药物和ATP与Pgp结合 P GP转运柔红霉素 DNR 跨膜两步过程 环孢素A CsA XR9576 XR 和长春碱 VL 在细胞浆侧面阻断 维拉帕米 VER 在细胞外侧阻断 优先占领 2 P GP底物P GP有各种类型的底物如秋水仙碱阿霉素 长春碱 脂质 类固醇 化学异物和多肽等 似乎无共性 1 多数底物是两性分子2 化合物脂溶性和氢键的数目决定底物与P GP亲和力的重要参数 脂溶性大或氢键数目多 P GP的亲和性高 电子供体基团间距离有一定范围是识别P GP结合点必需的 至少其中一个2 5 0 3 另一个为4 6 0 6 MDR1P GP抑制剂第一代P GP抑制剂如维拉帕米 环孢素A第二代或第三代抑制剂PSC833 GF120918 P GP生理功能1 肿瘤细胞耐药原因之一诱导性2 正常体内 生理性屏障 肠上皮 脑血管内皮细胞 胆小管上皮细胞 胎盘合胞体滋养细胞 1 血脑屏障在脑血管内皮细胞腔侧面表达丰富的P GP 成为许多药物难以通过血脑屏障的原因 一些疾病如癫痫诱导P GP表达 成为顽固性癫痫的原因之一炎症下调P GP表达 导致血脑屏障的通透性显著增加 Fig WesternblotshowedexpressionofP gpfromthecerebralcortexofnormalratsandPTZ kindledrats n 3 p 0 01vsNormal Fig P gpfunctionalactivityinhippocampusandcerebralcortexofnormalratsandPTZ kindledrats Samplesof60minafterasingledoseof0 2mg kgRh123 n 4 p 0 05 p 0 01vsNormal Fig DistributionofPBinbraintissuesofnormalrats kindledratsandkindledratstreatedwithCsA 5mg kg Samplesof60minafterasingledoseof10mg kgPB Datawereexpressedasratiovaluesasmean SD n 4 p 0 05 p 0 01vsnormalrats p 0 05 p 0 01vskindledrats 2 在肝 胆和肠中作用生物利用度的原因 1 保护机制防止毒物由胃肠道进入体内 2 肠上皮细胞中P GP分泌功能成为许多药物吸收差的原因之一 成为药物口服吸收的障碍 野生型小鼠灌胃50mg kg紫衫醇约有95 的药物原型从粪中排泄 同时口服P GP抑制剂环孢素A 50mg kg PSC833 50mg kg GF120918 25mg kg LY335979 80mg kg 或R101933 80mg kg 显著降低粪中原型药物的排谢分数 分别为32 4 12 5 6 2 34 9 和73 6 在mdr1a 1b基因敲除小鼠 粪中原型排泄分数只有6 3 P gP介导的药物外排 符合载体转运的特点 存在饱和特性某些底物的M M常数 不同底物和剂量肠道P GP的作用是不同的 A 地高辛通常剂量是0 5到1mg 肠内的浓度不到10 mol l 低于Km58 mol l P Gp在吸收方面有重要的意义 可能是该药物吸收程度地和变异大的主要原因 B 剂量大于50mg 肠内药物浓度达到mmol l水平 可能超过相应药物的Km值 P GP的活性处于饱和 P GP对药物吸收的贡献不大 Indinavir P GP的底物 剂量高达800mg 肠内浓度超过1mmol L 远远大于Km140 mol L p GP的作用对贡献不大 仍然有好的生物利用度 C 一些药物如环孢素 200 700mg 紫杉醇 100 200mg 尽管剂量很高 由于这些药物的溶解度和释放度低 肠内的浓度低于Km值 但P GP对吸收的影响仍然很大 D 某些药物吸收程度随剂量增加而增加如 S talinolol计量校正的AUC由12 5mg剂量的18 g h l增加到200mg剂量的36 g h l 4 肠中P GP也是机体重要保护机制之一 免受各种肠中毒素的侵害 如Mdr1a缺陷小鼠产生一种大肠炎症 类似人类的肠内部炎 正常情况下 肠中的P GP阻止毒素进入肠壁内 复杂性和注意问题 抑制胃肠道上P GP功能 必然降低屏障功能 增加毒物 素 进入体内 肠不同部位P GP的表达不同 图6 人肠中不同部位P gp和villinIODratio比值平均和变异 1 2代表十二指肠 近端空肠 3 4 5 6 和7 8分别代表中段至远端空肠 近端回肠支远端回肠 3 胎盘屏障P GP存在于胎盘合胞体滋养层顶侧面膜 类似于血脑屏障 防止有毒物质从母体进入胎儿 在P GP缺陷或基因敲除动物 avermectin 地高辛 saquinavir和紫杉醇通透性增加10 20倍 对于多数治疗药物而言 在胎盘上的低通透性当然是需要的 但在有些情况下 成为治疗上的障碍 如对于HIV治疗 希望在婴儿出生前 有一个合适的 负荷剂量 降低在出生过程中母 婴HIV感染的频率 乳腺癌耐药蛋白 BCRP 1 乳腺癌耐药蛋白 breastcancerresistanceprotein BCRP ABCG2 BCRP只有一个NBF和TM域 为半ABC载体 BCRPmRNA最早发现于胎盘中 BCRP首先是从乳腺癌细胞中分离得到的 称之为乳腺癌耐药蛋白 第一次在耐阿霉素的MCF7乳腺癌细胞株 MCF 7 AdrVp 中克隆到BCRP 鼠类命名为Bcrp1BCRP是细胞株对丝裂霉素 阿霉素和柔红霉素抗癌药物等产生耐药的主要原因 BCRP主要在细胞膜上 存在于细胞的顶侧面上 2 BCRP Bcrp1介导的耐药BCRP的底物与P GP MRP1和MRP2的底物间有较大的重叠性细胞株对丝裂霉素 拓朴替康 9 氨基喜树碱 柔红霉素 SN 38 flavopiridol 吲哚咔唑 拓朴酶抑制剂 NB 506和J 107088 细胞染料如罗丹明123 Lysotracker绿 BBR3390以及荧光素 BODIPY prazosin 对长春新碱 紫杉醇和顺铂等抗癌药无耐药性 不同药物诱导表达的结果往往存在差异 某些药物诱导表达BCRP细胞株对蒽醌类有很高的耐药性 而另一些药物诱导BCRP表达的细胞株 相对丝裂霉素而言 则对蒽醌类几乎没有耐药性 有些诱导表达BCRP细胞株对拓朴替康的耐药性相当高 但另一些诱导表达BCRP细胞株的耐药很低 存在两种突变株 野生型482位上的氨基酸为Arg两种突变型 Thr和Gly 不同的BCRP对底物的作用不同 野生型与突变型比较野生型突变型482位AArgThr或Gly底物叶酸及其衍生物 罗丹明123 LysoTracker绿 柔红霉素 丝裂霉素 bodipy prazosin Hoechst33342 抑制剂新生霉素 3 BCRP Bcrp1抑制剂 1 GF120918 P GP抑制剂 也是有效的BCRP Bcrp1抑制剂 抑制药物外排泵BCRP和P GP 2 fumitremorginC FTC 是有效的BCRP 抑制剂 但在体有神经毒性 其中两种类似物Ko132和Ko134 活性比FTC大 Ko134细胞毒性很低 在体可以用很高剂量 可以显著增加小鼠口服拓扑替康的生物利用度 3 某些HIV蛋白酶抑制剂强效的BCRP抑制剂 z在表达野生型BCRP的HEK细胞株中 ritonavir saquinavir和nelfinavir是有效地抑制BCRP介导的丝裂霉素转运 其IC50分别为19 5 19 5和12 5 mol l 4 植物酚类化合物 5 7 二羟黄酮 Chrysin 和biochaninA silymarin 橙皮素 hesperetin 栎精 quercetin 黄豆苷 daidzein stilbeneresveratrol 5 香豆霉素抗生素 新生霉素 6 酪氨酸激酶抑制剂 STI 571 imatinibmesylate ZD1839 Iressa gefitinib 和N 4 3 溴苯 胺 6 喹唑啉 2 丁胺 EKI 785 4 BCRP Bcrp1组织分布在人的胎盘中 BCRPmRNA表达非常高 而在鼠类胎盘相对弱 相反 在小鼠的肾脏表达最高 而在人的肾脏表达低表达 BCRP在胎盘合胞体滋养层膜的母体侧 在肝细胞的胆管侧 肠的腔面侧膜 与MDR1P GP的定位相似 BCRP也存在与乳腺的小叶和排泄管的顶侧面 BCRP高表达于鼠原始造血干细胞中 分化的造血干细胞系中 几乎不表达 但前红细胞和自然杀伤淋巴细胞可以表达Bcrp1 在人中 BCRP表达与鼠相类似 在干细胞中有较高的表达 而在起源细胞表达降低 只有在自然杀伤细胞和成红血球细胞表达 而在其他分化的细胞中没有表达BCRP在脑血管内皮细胞高度表达 表达量高于MDR和MRP1 3 BCRP Bcrp1药理生理作用1 BCRP分布与P GP有重叠性提示BCRP Bcrp1的作用类似P GP 2 保护机制阻止从胃肠吸收毒物吸收 促进排泄脱镁叶绿 甲酯 酸A PHA 是叶绿素一种降解产物 为一种光毒性成分 PHA在体内外排转运是BCRP介导的 为ABCG2的特异性底物 一项研究显示Bcrp1 小鼠对的PHA光毒敏感性是的野生鼠100倍以上 在敏感性增加的同时 伴随随高的血药浓度 与正常食物比较 喂养含PHA或含20 紫花苜蓿食物后 血药浓度分别增加17和24倍 而野生鼠喂养任何食物 血浆中PHA浓度都在检测浓度以下 3 血脑屏障的重要组成部分之一 与野生型鼠比较 mdr1a缺陷小鼠和野生型小鼠 长春碱脑摄取增加2倍 但哌唑嗪摄取不变不影响 丝裂霉素的摄取反而有所降低 合用GF120918使哌唑嗪和丝裂霉素转运增加2 1和3倍 但GF120918不影响长春碱的转运 在野生型鼠 PSC833增加长春碱的脑摄取 但不影响和丝裂霉素的摄取 合用GF120918使哌唑嗪和丝裂霉素摄取分别增加1 5和2倍 GF120918也使长春碱的摄取增加 abcg2mRNA主要在脑微血管中表达 约是皮层的700倍 4 在骨髓细胞的 傍细胞群 sidepopulation SP 中作用 从骨髓中分离到一类细胞 这类细胞用Hoechst33342染色 结合双波长荧光显示浅红色和浅蓝色荧光 用维拉帕米预处理 浅着色细胞消失 这类细胞称之为傍细胞群 浅着色提示细胞内Hoechst33342浓度低 研究显示在SP细胞中表有BCRP Bcrp1 促进Hoechst33342外排所致 SP中富含未分化的干细胞 而在分化的干细胞系中BCRP Bcrp1表达低或缺乏 类似SP也出现在骨骼肌和胚胎等其他组织干细胞 伴随Bcrp1的高表达 BCRP Bcrp1高表达可能是各种干细胞的一般特性 功能 ABCG2基因缺陷引起骨髓中和骨骼肌中SP细胞数降低 用转染BCRP 骨髓细胞移植小鼠内导致细胞再注入 repopulation 能力降低 造血细胞对丝裂霉素敏感性增加 与正常小鼠比较 Mdr1a 1b和Bcrp1缺陷小鼠研究的各种造血功能正常 在SP几乎消失 血祖先细胞对丝列霉素的敏感性增加 用Bcrp 和Bcrp 小鼠祖先细胞研究显示 在正常氧功能条件下 两种细胞的克隆数相同 但缺氧条件下 Bcrp 小鼠祖先细胞的克隆数下降 阻断BCRP功能显著降低Bcrp 在缺氧条件下的生存力 ABCG2mNRA在造血干细胞 SP 34 38 34 KDD 细胞群 中表达高 而在定向分化的祖细胞 34 33 34 10 中表达显著下降 在大多数成熟细胞中 表达低 但在自然杀伤细胞和成红血球细胞表达高 ABCG2可能对造血干细胞中SP形成起重要的贡献 在定向分化阶段 ABCG2下调 暗示该基因可能在多能干细胞方面有独特的生理功能 P GP MRP1和MRP2的协同转运 1 协同转运许多ABC载体能同时转运多种不同底物 可能存在协同转运 增加转运效率 MRP1转运长春新碱和依托甙需要还原型GSH参与 GSH促进MRP1依赖性的依托甙或长春新碱转运 长春新碱和依托甙也刺激MRP1 依赖性的GSH 用转染的MRP2的Sf9细胞膜囊摄取试验显示不同物质对MRP2转运雌二醇 17 葡萄糖醛酸甙作用不同 4种类型 1 刺激摄取sulfanitran pantoprazole 奥米拉唑 laneoprazole 丙磺舒 squinavir 醋氨酚 葡萄糖醛酸甙 青霉素G 2 低浓度刺激转运 高浓度刺激作用降低利尿磺胺 苯磺唑酮 吲哚美辛 glibenclamide 牛磺胆酸和甘胆酸 3 抑制摄取GSSG GS DNP4 无影响MTX和GSH P GP介导的转运有类似的现象 P GP有两个不同的正相协同的结合点和转运点 一个倾向于模型底物Hoechst33342 另一个倾向于罗丹明123 一些化合物 不是所有的 根据他们的刺激罗丹明123转运和抑制Hoechst转运能力大小归为Hoechst H 类或罗丹明 R 类 BQ102促进P GP转运柔红霉素和阿霉素 这种促进可以被维拉帕米抑制 对不同的底物作用不同 由于BQ102促进物质转运 降低细胞对某些底物的毒性 图维拉帕米抑制QB102促进细胞外排罗丹明123作用 a 维拉帕米对抗QB102 介导细胞内罗丹明123浓度降低 b 罗丹明123消失曲线 QB102对细胞对不同P GP底物的敏感性的影响 KB8 5 11细胞在有10 mol l或没有QB102存在情况下 与受试药物工培养3天 测定IC50 结果为IC50变化情况 意义化合物间交叉刺激或抑制有时是很复杂的 药物转运刺激程度有时相当大 当刺激剂同时服用时 由于促进药物转运 可能会改变相应药物的药理作用 尤其是药物在肠上皮 血脑屏障 胎盘屏障上的转运 因此研究是否存在交叉激活现象很有意义 一方面肠中MRP2 P GP的转运激活 可能导致药物的口服利用度降低 从而降低疗效 另一方面促进有毒物质的排泄