基因扩增技术(PCR)

PolymeraseChainReaction聚合酶链反应 PCR Polymerasechainreaction又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法 在模板DNA 引物 模板两端的已知序列 和四种脱氧核苷酸存在的情况下 DNA聚合酶依赖的酶促合成反应 PCR的定义 PCR技术是由Cetus公司和加利福利亚大学1985年联合创造的 主要贡献者为KaryBmulis和HeneryA Erlich 可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍 能检测每10万个细胞中仅含一个靶DNA分子的样品 因而发明人KaryB mulis获1993年诺贝尔化学奖 1993年获诺贝尔化学奖 PCR的种类 RT PCR 反向PCR 不对称PCR 多重PCR 巢式RT PCR 实时定量荧光PCR PCR温度循环参数 变性 denature 温度和时间模板DNA的变性 模板DNA双链在93 96加热2 10 解离 经PCR扩增形成的双链DNA在93 96 C加热30 1 退火 anneal 温度和时间 Tm 5 C温度降至55C左右 特异引物与模板DNA单链配对结合 延伸 extend 温度和时间 72 C1000碱基 分钟在TagDNA聚合酶的作用下 以dNTP为反应原料 靶序列为模板 引物为起始点 按碱基配对原理合成一条新的复制链 循环数在25 30个循环内 扩增的DNA量增加明显 然后进入平台期 靶序列的初始浓度越低 所需循环数越高 PCR扩增效率 理论 以上三步为一个循环 每一循环的产物可以作为下一个循环的模板 从理论上讲 每经过一循环 样本中的DNA量应该增加一倍 扩增DNA产量是以指数形式上升的 既n个循环后 产量为2n 经过25 30个循环后DNA可扩增106 109倍 PCR扩增效率 实际 实际上 PCR扩增效率比理论值要低 对于不同的基因来说 扩增效率也大不相同 如图所示 经过一定循环数之后 PCR产物的量增长缓慢 进入所谓的 平台期 在PCR扩增反应达到平台期前 模板扩增产物 N 与启始模板 N0 之间呈下列方程所示关系 N N0 1 E n其中E是扩增效率 n是循环数 演示PCR反应的过程 PCR反应体系组成 1 DNA模板 2 引物 3 dNTP 4 耐热的DNA聚合酶 5 10 PCR缓冲液 含Mg 模板核酸 PCR可以以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增 RNA的扩增必须经逆转录成cDNA后才能进行正常的PCR循环 称为RT PCR PCR反应中模板加入量一般为102 105个拷贝的靶序列 人工合成的寡核苷酸 引物 PCR扩增产物的特异性和扩增片段的大小是由引物限定的 因此 引物的设计对PCR的成功与否有决定性的意义 引物设计原则 软件 经验 引物长度以15 30个碱基为宜 引物碱基尽可能随机分布 G C含量宜在45 55 左右 引物内部不应形成二级结构 两个引物之间不应形成二级结构 引物与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性 两个引物的Tm值要尽可能接近 一般PCR反应中引物的终浓度为0 1 1 mol L 在此范围内产物量基本相同 引物浓度低于0 1 mol L时 产物量降低 引物浓度过高会引导非特异产物扩增 还会增加引物二聚体的形成 引物浓度对PCR反应的影响 合适的缓冲体系 目前最常见的缓冲体系为10 50mmol LTris HCl pH8 3 8 8 20 Tris是一种双极性离子缓冲液 其主要作用是维持碱性的Taq酶作用环境 在缓冲液中加入明胶或无核酸酶的BSA 对酶有一定的保护作用 Tween 20 0 05 0 1 及5mmol L的二硫苏糖醇 DTT 也有类似作用 尤其在扩增长片段 延伸时间长 时 加入这些酶保护剂对PCR反应是有利的 Mg2 Mg2 是TaqDNA聚合酶活性所必需的 Mg2 浓度直接影响着酶的活性与忠实性 引物的退火 模板与PCR产物的解链温度 产物的特异性以及引物二聚体的形成等等 因为 PCR反应混合物中的DNA模板 引物和dNTPs的磷酸基团均可与Mg2 结合 降低Mg2 的实际浓度 TaqDNA聚合酶需要的是游离的Mg2 因此 PCR中的Mg2 的加入量要比dNTPs的浓度要高0 2 2 5mmol L 最好对每种模板DNA 每种引物都进行Mg2 浓度的优化 三磷酸脱氧核苷 dNTPs 四种三磷酸脱氧核苷 dATP dCTP dGTP dTTP 是DNA合成的基本原料 工作浓度应为20 200 mmol L 所用的四种dNTP的浓度应相等 以使错误掺入率降至最低 dNTPs浓度过低则反应速度下降 dNTPs浓度过高则扩增特异性降低 而且当dNTP浓度高于50mM时也会抑制TaqDNA聚合酶的活性 耐热DNA聚合酶 Taq聚合酶是从耐热菌 thermusaquatious 中提取出来的耐热酶 95 仍有活性 该酶的应用浓度一般为1 2 5U 100 L反应体系 然而 酶的用量可依据不同的模板分子或引物而变化 酶浓度过高时 会出现非特异性扩增 过低时扩增产物量很低 试剂原液浓度工作浓度50 l体系PCR缓冲液10 1 5 L上游引物50 mol L0 5 mol L0 5 L下游引物50 mol L0 5 mol L0 5 LdNTPs10mmol L200 mol L4 LMgCl225mmol L1 5mmol L1 5 LTaq酶5U L2 5U 100 L体系0 25 LDNA模板102 105拷贝ddH2O补足50 L PCR混合液 PCR产物的分析 半定量RT PCR原理 持家基因 在所有类型组织和细胞中普遍表达恒定的基因 如 2微球蛋白 肌动蛋白和GAPDH基因 在逆转录过程中 持家基因 的mRNA与待测模板的mRNA共同逆转录为cDNA 因此排除了cDNA合成效率不同所引起的误差 在此后的PCR反应过程中 持家基因 的cDNA与待测模板cDNA用不同的两对引物在同一PCR体系内扩增 待测模板扩增产物与该样品 持家基因 扩增产物的比值可以反映待测模板表达量的相对高低 持家基因选择的原则 在欲分析的组织或样品中该持家基因的表达稳定 RNA特异性的检测 注意假基因的干扰 持家基因的拷贝数和预测基因的拷贝数在同一线性范围内 常用持家基因表达的稳定性 常用持家基因在基因组序列中存在假基因情况 不同类型细胞中持家基因表达的稳定性 Vandesompele J K DePreter etal GenomeBiol 2002 不同类型组织中持家基因表达的稳定性 deKok J B R W Roelofs etal LabInvest 2005 在前列腺癌组织中一些持家基因表达的稳定性 Fig SelectionofthemostsuitablereferencegenesfornormalizationinprostatecancersamplesusinggeNormanalysisbycalculatingtheaverageexpressionstabilitymeasureM andtheleaststablegenewiththehighestMvalue Ohl F M Jung etal JMolMed 2005 PCR产物的分析 如何调整PCR产物在直线期 一管PCR法 减少持家基因引物量 两管PCR法 同一混合液 同一PCR程序 如何调整不同样品间持家基因的差异RNA水平调整 加大模板量 cDNA水平调整 加大模板量 最多2uL 电泳水平 持家基因与欲测基因体积一致 待测模板的相对含量 样品荧光强度 内参照模板的荧光强度 RT PCR实验的策略 1 热启动Taq酶在低温下仍有活性 故PCR混合物在显著低于Tm值的温度下 Taq酶可催化引物与模板的非特异复性或引物二聚体的形成 在第一个循环的变性温度加入Taq酶 将含有Mg2 的石蜡珠放在管内 待达到变性温度时 石蜡熔化 Mg2 进入反应液中 起始反应 在PCR反应液中 加入Taq酶的单克隆抗体 在温度升高到将中和抗体变性失活之前 抗体与Taq酶结合 使其不能发挥作用 RT PCR实验的策略 2 优化Mg2 浓度应用不包含Mg2 的PCR缓冲液 将10mmol LMgCl2贮存液逐一加入反应管中 开始以0 5mmol L递增 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3mmol L 在确定了Mg2 大概浓度后 再在该浓度上下 以0 2mmol L递增和递减几个浓度来精确确定Mg2 的最合适的浓度 RT PCR实验的策略 3 退火温度和时间Tm 4 G C 2 A T 简单计算法从退火温度低于Tm值5C开始 由低往高优化 欲增加DNA扩增产物 可在前5个循环增加退火时间 如2分钟 其次的循环中退火时间为1分钟 4 缩短合成时间 适用于非特异大片段 RT PCR实验的策略 5 模板中G C比例过高可加1 10 二甲基亚砜 DMSO 使模板易于解链和引物特异性的结合 6 若不出DNA扩增带 用持家基因引物做PCR 首先排除模板问题 在依次寻找其它原因 引物不特异 退火温度过高 Mg2 浓度不合适或试剂出现问题等 7 对很难扩增的片段可考虑用下游引物反转录 8 对长片段的策略 RT PCR实验的策略 PCR污染的对策 1 隔离不同的实验操作区 将提取RNA操作区 引物分装区 PCR操作区及PCR产物分析区分开 2 分装试剂 把试剂分装成小份 在冰箱中保存 目的是为了减少重复取样所造成的污染 3 改进实验操作 实验时戴一次性手套 加样中要避免反应液的飞溅 在操作多份样品时 要制备标准混合液 将各组分混匀后再分到不同的管 这样可以减少操作污染 并且提高微量加样的精确度 PCR污染的对策 4 设置对照阳性对照 用已知的阳性模板 阴性对照 加无关的或不加模板DNA 重复实验 为防止因各种原因引起的实验误差 应进行反复验证 以确保实验结果的重演性 污染的处理 酸处理 用1M的稀盐酸擦拭或浸泡污染器件 可促进DNA脱嘌呤 紫外灯照射 UV波长一般选择254 300nm 照射30分钟即可 紫外照射可促使DNA形成二聚体 阻止链的延伸 紫外照射对长片段的DNA有效 对短片段效果不大 巢式PCR nestedPCR 对于极微量的靶序列 一次扩增很难取得满意的效果 则可用巢式PCR进行多次扩增 引物之间的关系如下图所示 引物1和引物4进行第一次扩增 其产物作为模板 用引物2和3作为再次PCR的引物 如果一次PCR产物在凝胶上有可见的条带 二次PCR只能用第一次PCR产物的1 104 105为模板 实时定量荧光PCR 实时PCR realtimePCR 是1996年以来发展起来的一种新技术 1 荧光定量PCR技术的整个操作过程在完全封闭的状态下进行 有效的避免了 假阳性 的实验结果 2 荧光探针的使用提高了检测灵敏度和特异性 并能够准确定量样品的模板数 3 PCR扩增后不需进行电泳等后处理 而直接定量样品模板数 使其具有分析时间短 重复性好 省力 低费用等优点 TaqMan探针 ATaqMan探针同时带有荧光报道子和淬灭子 无荧光信号发生 B在退火阶段 引物和探针同时与模板结合 C在延伸阶段 Tag酶将探针水解 报道子被切割 使得荧光信号释放 荧光信号的强弱与模板的量成正比 荧光染料掺入法 某些染料能够特异性地结合到双链DNA上 而不结合到单链DNA上 而且与双链DNA结合后的染料发光强度会明显增加 检测结合到双链DNA上的荧光染料发出的荧光可实时监测PCR扩增产物的数量 SYBRGreenI是一种结合于DNA双螺旋小沟中的荧光染料 其最大吸收波长约为497nm 最大发射波长约为520nm 优点 1 由于它与所有的双链DNA相结合 不因模板不同而特别定制通用性好 且价格相对较低 2 由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合 因此其灵敏度很高 缺点 1 由于SYBRGreenI与所有的双链DNA相结合 引物二聚体 单链二级结构以及非特异扩增产物可引起假阳性 因此 只限于分析特异性扩增产物 可用溶解曲线分析产物的特异性 染料可影响扩增效率 实时定量PCR的Ct值概念 Ct值是实时定量PCR技术中进行定量的一个重要参数 阈值是显著大于背景信号的荧光信号值 它总是出现在扩增的指数期 达到荧光阈值所需的最小循环数为Ct值 在反应的起始 模板数越多 达到荧光信号阈值所需的循环数越少 实时定量PCR检测前列腺基质细胞中GAPDH和TGFb1表达的荧光曲线图 SYBRGreenI掺入法 实时定量PCR检测前列腺基质细胞中GAPDH和TGFb1表达的熔解曲线图 单一峰表明产物是单一的 无非特异扩增 实时定量PCR检测前列腺基质细胞中TGFb1的表达 Ct 目的基因的Ct值 内参照基因的Ct值 Ct 实验组样品的 Ct 对照组样品的 Ct 实时定量PCR检测前列腺基质细胞中TGFb1表达的柱形图 TaqMan探针检测PSA质粒 107拷贝至103拷贝 的荧光曲线图 TaqMan探针检测PSA质粒的Ct值得出的标准曲线y 0 23x 11 06 r2 0 993 y是模板的对数 x是Ct 实时PCR定量检测将LNCap细胞梯度掺入到4ml外周血中PSA的表达 TaqMan探针方法 根据回归方程和Ct值 计算的得到的PSA的拷贝数 之间相差没有10倍 可能是扩增效率的原因 因为扩增质粒的效率是最高的 谢谢