免疫组化实验步骤.doc

石蜡切片免疫组化实验步骤石蜡切片步骤按照晓峰整理的步骤进行（From 徐晓峰、朱老师的“石蜡切片”方案）：1）材料的准备在本实验室条件下推荐使用FAA（50% ethanol, 5% acetic acid, 3.7% 甲醛）固定材料。 FAA固定液（100ml），室温保存 ：无水乙醇 50ml冰醋酸 5ml37%甲醛 10ml水 35ml第一天：组织固定用FAA固定，详见“石蜡切片”protocol。第二天：脱水Solutiontimenumber of changes50% ethanol60 minutesone60% ethanol60 minutesone*70% ethanol60 minutesone以上所有步骤中每换好一步乙醇均置于4冰箱等待，并不时轻摇。* 组织可在70% ethanol 4可存放几个月第三天：进一步脱水和浸蜡以下所有步骤在4进行并不时轻摇Solutiontimenumber of changes85% ethanol60 minutesone95% ethanol 60 minutesone以下所有步骤在室温进行并不时轻摇Solutiontimenumber of changes100% ethanol 30 minutestwo100% ethanol 60 minutestwo25%二甲苯, 75% ethanol30 minutesone50%二甲苯, 50% ethanol30 minutesone75%二甲苯, 25% ethanol+番红30 minutesone100%二甲苯60 minutestwo100% 二甲苯 + 1/4 volume Paraplast Plus (paraffin) chipsovernight(不要摇动)准备工作：60预热plus蜡片（Paraplast Plus） 石蜡可反复融凝而去气泡第四天：浸蜡 2将材料置于42直至蜡块完全熔化。再加1/4体积的蜡块至完全熔化后移至60。几个小时后换上新鲜熔好的蜡液，过夜。第五天：浸蜡 3换蜡两次（Paraplast Plus）第六天：浸蜡 4换蜡两次（Paraplast Plus）第七天：浸蜡 5换蜡两次（Paraplast Plus）准备工作：60预热Regular蜡片（Paraplast Regular）第八天：包埋（包埋块可长久保存） 第九天及之后：开始切片，切片应包括自己的片子及正负对照等。事先打开烘片机至37度，在涂有多聚赖氨酸的玻片上加12ml的蒸馏水。切好的片子轻至于加水的玻片上。待所有片子准备完之后盖上盖子，烘片过夜。用自来水及双蒸水清洗免疫组化专用塑料，放在烘箱烘干待用。第二天：开始脱蜡（From 徐晓峰、朱老师整理的“石蜡切片”protocol）Solutiontimenumber of changes100%二甲苯10 minutestwo100% ethanol1-2 minutestwo95% ethanol1-2 minutesone90% ethanol1-2 minutesone80% ethanol1-2 minutesone60 % ethanol1-2 minutesone30 % ethanol1-2 minutesonewater1-2 minutesonePBS(PH=7.4)5 minutesone PBS(PH=7.4)5 minutesone（用新买来的免疫组化塑料小盒，每一步只需加入试剂220250毫升）抗原修复：在切片还浸入酒精时，可以事先将煮锅清洗干净，用蒸馏水洗12遍，最后加入0.01M柠檬酸钠缓冲液(PH=6.0)，煮沸(保持在95度左右)，将过完PBS的片子让入煮沸的锅中，煮片1015 min。然后将电磁炉关闭，自然冷却锅中切片（千万不要把片子拿出来，放在缓冲液中一起自然冷却至室温！） 将片子浸入PBS（PH=7.4）5 min。 重复一遍。封闭：在抗原修复时可以事先配制封闭液，用PBS（PH=7.4）配制3% BSA的封闭液。将PBS中的切片放入封闭液中，室温放置30分钟1小时。杂一抗： 在封闭时可先剪好与切片大小相当的封口膜，并准备加有少量水的塑料大盒，用卫生纸垫在塑料大盒中附带的塑料板上。用封闭液稀释一抗(GFP兔多抗以1:100稀释，其它一抗需要另外尝试)。将稀释完的一抗加在片子上，每张片子保证不少于100ul，用封口膜封上，检查是否有汽泡，轻轻赶走气泡。将片子放在塑料大盒中，盖上塑料盖子，放入冰库过夜。杂二抗： 事先配制好TBS(PH=7.4)缓冲液，用TBS（PH=7.4）缓冲液稀释带有碱性磷酸酶(AP)标记的抗兔二抗，比例为1:200。将塑料大盒从冰库中拿出，浸入TBS（PH=7.4）缓冲液中洗一抗，5min，重复3次，在洗一抗的过程中准备封口膜。将片子上的残余缓冲液倒去（但片子必须保持湿润！）每张片子加不少于100ul的二抗稀释液，盖上封口膜，放入塑料大盒中，室温放置11.5小时。洗二抗并显色 用TBS(PH=7.4)缓冲液洗二抗，5min,重复3次。同时在暗处配制显色液（40ul溶液A+40ul溶液B+720ul水，可根据实际切片数量按比例配制显色液），剪切封口膜。将片子至于暗处，倒去缓冲液，每张片子加不少于100ul的显色液，轻轻盖上封口膜，放于暗处进行显色。每隔15分钟左右看一下片子是否开始显色(根据经验，加入显色液30min1小时会开始显色,但是需要根据不同蛋白表达强弱，把握显色时间)。发现显色之后需加蒸馏水终止反应，再盖上盖玻片进行观察并拍照。试剂：1. 0.01M PBS（PH=7.4）: 购买的小包装粉末，溶于1L水中，待粉末溶解后调PH值至7.4。2. TBS: 2.4g Tris, 8.8g NaCl溶于1L水中，调PH值至7.43. 0.01M 柠檬酸钠缓冲液(PH=6.0)： 2.94g 柠檬酸三钠2H2O溶于1L蒸馏水中，用固体柠檬酸调PH至6.04. 3%BSA封闭液 7.5g BSA溶于250毫升PBS(PH=7.4)中。