细胞免疫荧光实验步骤.doc

细胞爬片免疫荧光实验步骤第一天：1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min；3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4孵育过夜；第二天：6. 加荧光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。7. 复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min4次洗去多余的DAPI；8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。细胞免疫荧光步骤1.在24孔板里加500微升培养基，放爬片，接种细胞（做实验以30-50%汇合度较好。10000-30000左右2.给药处理24h。3.PBS洗三遍。4.4冷的多聚甲醛固定15分钟，PBS洗三遍，每次5min，摇床。（避光）5.0.5TritonX100（PBS配）破膜15min，PBS洗三遍，每次5min，摇床。6.5%BSA（牛血清白蛋白，PBS配）封闭60分钟,不用洗。7.加一抗孵育（5%BSA配），4摇床过夜。8.收集一抗，PBS洗三遍，每次5min，摇床。孵育二抗AlexaFluor488（1:1000）,室温60min（避光）9. 回收二抗，PBS洗三遍，摇床，每次5min。10. 0.5ug/mLDAPI（5%BSA配，2滴/ml）染核15min。（避光）11.PBS洗三遍，每次5min，摇床。12.取载玻片，滴加10uL抗荧光衰减封片剂，将爬片有细胞面盖在封片剂上，指甲油封片子的对角线。Allstepsfor IF 1)Removeculturemediumandfixcells(acommonfixativeis4%formaldehydeinPBS,for15minutes)2)WashwellinPBS(3x5minutesistypical)3)Permeabilizethecells(acommonpermeabilizationreagentis0.2%TritonX-100inPBSfor30minutes)4)WashwellinPBS5)(optional:Blockfornon-specificdyebindingusingtheImage-iTFXImageEnhancerSolution,I36933)6)Blockfornon-specificantibodybinding30-60minutes(acommonblockingsolutionwouldbe3-6%bovineserumalbumin/5%normalgoatserum/PBS,orcommercialblockingreagentslikeourBlockAid,productB10710)7)Incubateinprimaryantibodyfor30-60minutes,inblockingsolutionorovernightat4degrees(antibodyconcentrationsvary,butusuallybetween0.5-10ug/mL)8)WashwellinPBS9)Incubateinsecondaryantibodyfor30-60minutes,in3-6%bovineserumalbumin/PBS(agoodstartingantibodyconcentrationis5ug/mL)10)WashwellinPBS11)Counterstainasneeded(suchaswithDAPI,D1306)12)Mountinappropriatemountingmedium(forfluorescentsecondaries,agoodantifadesolutionisbest,suchasProLongGold,P36934,orSlowFadeGold,S36937)