克隆载体的特征及类型.ppt

第四章基因克隆的载体 质粒 plasmid 噬菌体或病毒DNA 粘粒 cosmid 与噬菌粒 人工染色体载体 载体的功能及特征 载体 携带外源DNA进入宿主细胞的工具 能够运载外源DNA片段 目的基因 进入受体细胞 具有自我复制能力 使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达 不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子 第一节载体的功能及特征 载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 载体应具备的条件 有复制起点 在受体细胞中能自我复制 或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 具有筛选转化子的选择性标记基因 分子量小 拷贝数多 具有较高的外源DNA的载装能力 安全 不含对受体细胞有害的基因 不会任意转入受体细胞以外的其它生物细胞中 自主复制型载体和附加载体的扩增方式 载体的类型 应用范围 克隆载体 表达载体 应用对象 原核载体 真核载体 酵母 植物和动物 穿梭载体 构建来源 质粒载体 病毒或噬菌体载体 质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的载体 质粒DNA与染色体DNA片段组成的载体 克隆载体 cloningvector 用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体 一般具有较低的分子量 较高的拷贝数和松弛型复制子 表达载体 expressionvector 使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体 可将重组体DNA导入适合的受体细胞 使所载的目的基因能够复制 转录和翻译 穿梭载体 shuttlevector 又称双功能载体 能在两种不同的生物体内复制的载体 同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的病毒复制原点或酵母菌的自主复制序列 ARS 它既能在原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达 主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移 通常是将载体和待克隆的真核生物DNA片段先在细菌中克隆 再转移到真核细胞中表达 并可提高外源基因的表达效率 第二节质粒 质粒的基本特征 质粒是生物细胞内固有的 能独立于寄主染色体而自主复制 并 被稳定遗传的一类核酸分子 绝大多数的质粒是DNA型 质粒常见于原核细菌和真菌中 质粒DNA的分子量范围 1 200kb 天然DNA质粒具有3种构型 共价闭合环状 cccDNA 开环 ocDNA 和线性 lDNA 构型 Plasmidchromosome 绝大多数的天然DNA质粒具有共价 封闭 环状的分子结构 即cccDNA 质粒 质粒的基本特征 1 质粒的自主复制性 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制 质粒DNA的复制受质粒和宿主细胞双重遗传系统的控制 根据在每个细胞中的分子数 拷贝数 多寡 质粒可分为 两大复制类型 严紧型复制控制的质粒1 5拷贝stringentplasmid 松弛型复制控制的质粒10 60拷贝stringentplasmid 质粒 质粒的基本特征 质粒的自主复制性 拷贝数的控制机制 质粒DNA复制启动控制 控制复制引物与模板的结合 ori E coliColE1plasmid 复制方向 rop Rop RNAII RNAI 3 5 5 3 RNAII是复制的正向调节分子 RNAI是复制的负调节物 质粒 质粒的基本特征 质粒的自主复制性 拷贝数的控制机制 质粒DNA复制启动控制 控制复制起始因子与复制起始位点 ori 的结合 Pcop cop P Orep rep ori Cop Rep 质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系 质粒 质粒的基本特征 2 质粒的不相容性 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒 不能同时存在于 一个细胞中 这种现象称为质粒的不相容性 不相容性的质 以大肠杆菌的质粒为例 ColE1 pMB1拥有相似的复制子结构 彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构 彼此不相容 粒组成不相容性群 亲缘关系密切的质粒 野生型质粒与其衍生的重组质粒 质粒 质粒的基本特征 质粒的不相容性 分子机制 两种含有相似复制子结构的不同质粒 在复制时受到同一种 拷贝数控制系统的干扰 致使两种质粒的最终拷贝数不同 两种含有不同复制子结构的不同质粒 在复制时各受自己的 拷贝数控制系统的调节 致使两种质粒的最终拷贝数恒定 因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一 细胞内 亲和性质粒 其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势 质粒 质粒的基本特征 3 质粒的可转移性 革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类 接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到 另一个细胞 接合作用 如F Col R质粒等 如Col R的其它成员 非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用 值得注意的是 某些非接合型质粒 ColE1 在接合型质粒 的存在和协助下 也能发生DNA转移 这个过程由bom和 mob基因决定 由rec基因控制 使质粒整合到染色体基因组上 在基因工程应用的是重组缺陷型 rec 的质粒和菌株 质粒 质粒的基本特征 4 质粒的重组性 质粒 质粒的基本特征 5 携带特殊的遗传标记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因 这 使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状 包括 物质抗性抗生素 重金属离子 毒性阴离子 有机物 物质合成抗生素 细菌毒素 有机碱 这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义 利用抗性基因进行重组子的筛选 质粒基因编码的特性 Fertility F质粒 只含有tra基因 除了促进接合转移外没有其他功能 Resistance R质粒 含有氯霉素 青霉素等抗性基因 如RP4 发现于假单胞杆菌 Col质粒 编码大肠菌素 可以杀死其他细菌 如存在于E coli中的CoE1 降解质粒 Degradativeplasmids 可以降解特殊的分子如 甲苯 水杨酸 致瘤质粒 Virulenceplasmids 农杆菌Ti质粒 天然存在的两种质粒colE1宿主细菌大肠杆菌 6 5kb 松弛型复制20 30 cellpSC101宿主细菌沙门氏菌 8 8kb 严谨型复制5 cell 标记基因为Tcr 质粒 质粒的构建 理想的质粒载体应具备的条件 分子量较小 松驰型 在受体细胞中有较多的拷贝数 具有一个以上的选择标记基因 形成重组质粒后 至少还要有一个强的选择标记 具有允许外源DNA片段克隆的位点 并且位于选择标记基因区内 插入外源片段不影响质粒的复制功能 能够导入寄主细胞 具备转化的功能 操作简单方便 可根据需要加装其它元件 构建不同用途的质粒载体 天然存在的野生型质粒由于分子量大 拷贝数低 单一酶切位点少 遗传标记不理想等缺陷 因而不适合用作基因工程的载体 必须对之进行改造构建 1 加入合适的选择标记基因 如两个以上 易于用作选择 2 增加或减少合适的酶切位点 便于重组 3 缩短长度 切去不必要的片段 提高导入效率 增加装载量 4 改变复制子 变严紧为松弛 变少拷贝为多拷贝 5 根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件方法就是重组 拼拼接接 挖肉补疮 质粒人工构建的目的 质粒 质粒的分类 人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类 高拷贝质粒突变拷贝数控制基因拷贝数1000 3000扩增基因 低拷贝质粒来自pSC101拷贝数小于10表达某些毒性基因 温敏质粒在不同温度下表现出拷贝数 整合等不同性质 测序质粒含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker 整合质粒装有整合促进基因及位点便于外源基因的整合 穿梭质粒装有针对两种不同受体的复制子便于基因克隆 表达质粒装有强化外源基因表达的转录 翻译 纯化的元件 探针质粒装有报告基因便于启动子等元件的克隆筛选 质粒 重要的大肠杆菌质粒载体 松弛型复制 pBR322 氯霉素可扩增 拷贝数50 100 cell 用于基因克隆 优点 分子量小 4363bp 容易纯化 含有2个抗生素抗性基因Ampr和Terr 可以作为选择标记 而且每一个标记基因都含有单一的酶切位点 可以插入DNA amp基因内可被PstI PvuI SacI切开 而四环素抗性基因可被BamHI HindIII切开 通过插入失活筛选重组子 受体细胞内 pBR322以多拷贝存在 一般一个细胞内可达到50 100个 而在蛋白质合成抑制剂存在条件下 如氯霉素 可达到1000 3000拷贝 缺点 有被动迁移的可能 不够安全 抗生素标记插入失活筛选为负筛选法 比较麻烦 pBR322 Amp Tet 插入片段 Amp平板 Tet平板 质粒 重要的大肠杆菌质粒载体 pUC18 19 拷贝数2000 3000 cell 用于基因克隆和测序 装有多克隆位点 MCS 正选择颜色标记lacZ pUC18也来自于pBR322 但只保留了复制起点和ampR位点 ampR基因的序列已改变限制性位点不再存在 所有的克隆位点集中在lacZ基因内的一个小片段上 pUC18的优点 1 突变位点位于复制起点 提高了拷贝数 2 重组子的鉴定可一步完成 固体培养基中添加amp和X gal IPTG 节约了一半的时间 3 多克隆位点 可以使具有不同粘端的DNA片段插入载体 而不必连接linker 4 载体中的多克隆位点与M13mp系列的载体是相同的 因此 插入pUC系列的克隆DNA可以直接转入M13mp载体 可以进行DNA测序和体外定点突变 质粒 重要的大肠杆菌质粒载体 pUC18 19 正选择标记lacZ 的显色原理 pUC18 19 Plac lacZ MCS b 半乳糖苷酶的a 肽段 a b 5 溴 4 氯 3 吲哚基 b D 半乳糖苷 X gal 质粒 重要的大肠杆菌质粒载体 pGEM 3Z 多拷贝 装有两个噬菌体的强启动子 装有多克隆位点 MCS 正选择颜色标记lacZ 用于外源基因的高效表达 注意 T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合 2743bp MCS lacZ PT7 ori Apr pGEM 3E PSP6 酶所识别 因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶 如 E coliBL21 DE3 等 在重组的pGEM3Z载体中加入相应的RNA聚合酶 可以发生外源基因转录 质粒载体总体评价 操作简便克隆容量有限 10kb 第二节噬菌体或病毒DNA 噬菌体或病毒是一类非细胞微生物 能高效率高特异性地侵染 宿主细胞 然后或自主复制繁殖 或整合入宿主基因组中潜伏 起来 高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞 自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的l噬菌体DNA l噬菌体的生物学特性 生物结构 l噬菌体由外壳包装蛋白和l DNA组成 l DNA全长48502个核苷酸 l DNA上至少有61个基因 约有20kb的区域为为噬菌体生长非必需的 可以缺失或被外源DNA片段所取代 l噬菌体生物学特性 生物结构 5 TCCAGCGGCGGGG 3 3 CCCGCCGCTGGA5 COS COS cos 头部合成基因 尾部合成基因 溶菌控制基因 晚期控制基因 DNA合成控制基因 阻遏基因 早期控制基因 阻遏基因 重组基因 删除与整合基因 l DNA 黏性末端 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的l噬菌体DNA l噬菌体生物学特性 感染周期 E coli 吸附 LamB受体 注入 复制 包装 裂解 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的l噬菌体DNA l噬菌体生物学特性 感染周期 体内包装 100个左右的拷贝 包装范围为原DNA的75 105 即36 51kb D A 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的l噬菌体DNA l噬菌体生物学特性 溶原状态 l噬菌体感染大肠杆菌后 除能裂解细胞外 也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上 并不产生子代噬菌体颗粒 这种情况为溶原状态 人们可以根据需要改变l DNA或宿主细胞的性质 使噬菌体或处于溶菌状态 或处于裂解状态DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的l噬菌体DNA l DNA载体的构建 缩短长度 野生型l DNA包装的上限为51kb 本身长度为48 5kb 只有当插入的外源DNA片段不大于2 5kb时 才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒 因此缩短野生型l DNA的长度 可以提高装载量 其实野生型l DNA上约有40 50 的片段是复制和裂解所非必需的 根据切除的多少 可将l DNA分成两大类载体 插入型载体 取代型载体 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的l噬菌体DNA l DNA载体的构建 缩短长度插入型载体 体外包装 插入位点 体外包装 插入片段 载体长度37kb 插入片段大小 0 14kb 51 37 重组与否均可包装 因而为区分重组子与非重组子必须携带标记基因 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的l噬菌体DNA l DNA载体的构建 缩短长度取代型载体 体外包装 体外包装 插入片段 最小装载长度10kb 51 26 载体长度26kb 插入片段 最大装载长度25kb 36 26 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的l噬菌体DNA l DNA载体的构建 删除重复的酶切位点 野生型的l DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点 不 利于重组操作 必须删除至1 2个 同时 为了便于各种来源的DNA片段的克隆 还需要增加一 些单一的酶切位点 除了简单的切割外 还需要采用定点突变技术去除或增添酶 位点 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的l噬菌体DNA l DNA载体的构建 加装选择标记 与质粒不同 野生型l DNA上缺少合适的选择标记 因此 加装选择标记是l DNA克隆载体构建的重要内容 l DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类 免疫功能类标记 颜色反应类标记 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的l噬菌体DNA l DNA载体的构建 加装选择标记imm434 imm434基因编码一种阻止l 噬菌体 进入溶菌循环的阻遏物 含有完整标记 基因的l 载体进入受体细胞后 建立溶 原状态 细菌生长缓慢 形成浑浊斑 当外源DNA插入到标记基因中 基因灭 活 l 重组分子便进入溶菌循环 形成 透明斑 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的l噬菌体DNA l DNA载体的构建 加装选择标记lacZ lacZ基因编码b 半乳糖苷酶 能催化 无色的X gal生成蓝色化合物 当外源基 因插入到lacZ基因中 基因灭活 不能 合成蓝色化合物 而空载体l DNA则产 生蓝色透明斑 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的l噬菌体DNA l DNA重组分子的体外包装 l DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒 方可高效导入受体细胞用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取 现已商品化 这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分 一部分缺少E组份 另一部分则缺少D组份 包装时 当且仅当这两部分包装蛋白与重组l DNA分子混合后 包装才能有效进行 任何一种蛋白包装液被重组l DNA污染后 均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒 这也是基于安全而设计的 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的l噬菌体DNA l DNA及其重组分子的分离纯化 将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期 加入l噬菌体或重组l噬菌体的悬浮液 37 培养1小时 用新鲜培养基稀释 继续培养4 12小时 这时噬菌体颗粒 密度已达1013 1014 L 大肠杆菌细胞已完全裂解 超速离心 沉淀噬菌体 苯酚抽提 释放l DNA 乙醇或异丙醇沉淀l DNA 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的l噬菌体DNA l DNA作为载体的优点 l DNA可在体外包装成噬菌体颗粒 能高效转染大肠杆菌 l DNA载体的装载能力为25kb 远远大于质粒的装载量 重组l DNA分子的筛选较为方便 重组l DNA分子的提取较为简便 l DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段 但不适合表达 外源基因 第三节考斯质粒 l DNA载体装载量为25kb 但在很多情况下 往往需要克隆更大的外源DNA片段 考斯质粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA的装载量 在包装上限固定的条件下 大幅度缩短噬菌体DNA的长度 就能同步增加载体的装载能力 将噬菌体DNA与包装有关的序列与质粒组装在一起 既能最大限度地缩短载体的长度 同时又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒 这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路 当然 由于考斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因 因此重组DNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒 考斯质粒 cosmid 考斯质粒载体的构建 考斯质粒是一类人工构建的含有 1978年Collins和Hohn发明构建 pHC79 6400bp Tcr lfragment cos ori Apr PstI BamHI SalI l DNAcos序列和质粒复制子的 特殊类型的载体 cossite carryingplasmid 1 8kb的l DNA片段 pBR322片段 装载范围为31 45kb 考斯质粒 cosmid 考斯质粒载体的特点 能像l DNA那样进行体外包装 并高效转染受体细胞 装载量大 45kb 且克隆片段具有一定的大小范围 能像质粒那样在受体细胞中自主复制 重组操作简便 筛选容易 不能体内包装 不裂解受体细胞 人造染色体载体 人类 动物 植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百 甚至上千kb的DNA片段 此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载 量也远远不能满足需要 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区 分配区 稳 定区与质粒组装在一起 即可构成染色体载体 当大片段的外 源DNA克隆在这些染色体载体上后 便形成重组人造染色体 它能像天然染色体那样 在受体细胞中稳定的复制并遗传 目前常用的人造染色体载体包括 细菌人造染色体 BAC 酵母人造染色体 YAC 人造染色体载体 细菌人造染色体 BacterialArtificialChromosomesBAC 细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上 构建的 其装载量范围在50 300kb之间 各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝 pBACs主要适用于 克隆大型基因簇 genecluster 结构 构建动植物基因文库 人造染色体载体 酵母人造染色体 YeastArtificialChromosomesYAC YAC载体应含有下列元件 酵母染色体的端粒序列 酵母人造染色体的构建 pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 酵母染色体的复制子 酵母染色体的中心粒序列 酵母系统的选择标记 大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的选择标记 YAC载体的装载量为350 400kb 人造染色体载体 酵母人造染色体 YeastArtificialChromosomesYAC 酵母人造染色体的使用 EcoRI EcoRI EcoRI BamHI 连接 转化酵母菌 重组酵母染色体