维生素类药物的分析 (4)

第五章维生素类药物的分析TheAnalysisofVitamines 维生素是维持人体正常生理机能所必需的生物活性物质 如果人体缺少某种维生素 就会引起维生素缺乏症 而影响人体的正常生理机能 例如 VA缺乏 夜盲症VB1缺乏 脚气病 概述 脂溶性 水溶性 按溶解性分类 VA VD VE VK等 B族 VB1 VB2等 VC 烟酸 叶酸 泛酸等 第一节维生素A的分析 一 结构与性质1 化学结构 R HVA醇VA1R COCH3VA醋酸酯R COC15H31VA棕榈酸酯 1 环己烯 共轭多烯侧链 2 天然VA侧链为全反式 3 天然来源主要是鱼肝油 为醋酸酯 棕榈酸酯等 目前多由人工合成 结构特点 a 紫外吸收 具有共轭多烯侧链 紫外吸收 最大吸收波长在325 328nm 随VA存在状态以及所用的溶剂 最大吸收波长的位置有所不同 2 性质 不溶于水 溶于乙醚 氯仿 异丙醇 环己烷 脂肪和油 b 溶解性 共轭多烯侧链 性质非常活泼 c 不稳定性 维生素A的氧化产物 环氧化物 维生素A醛 维生素A酸 or 鉴别 含量测定 d 与SbCl3作用 Carr Price反应 无水 二 鉴别试验1 三氯化锑反应 无水 2 紫外吸收光谱VA的无水乙醇溶液在326nm有最大吸收 确认醇或酯 是醋酸酯或其他酸酯 例 VA和其标准品用环己烷溶解展开剂 环己烷 乙醚 80 20 板 硅胶G显色 SbCl3T S Rf VA醇0 08VA醋酸酯0 41VA棕榈酸酯0 75 3 TLC 三 含量测定 1 概述 共轭多烯的结构 具有特征的紫外吸收 相关物质 结构相似 维生素A最大吸收波长附近也有吸收 对测定有影响 Morton和Stubbs等人提出了三点校正法 紫外分光光度法 三点校正法 2 原理 根据 假定 物质对光的吸收具有加和性 即 维生素A中的不相关吸收在310 340nm范围内近似一条直线 效价为维生素A1的40 max345 350nm 3 相关物质的吸收 a 维生素A的衍生物 维生素A2去氢维生素A 效价低于维生素A1 max385 390nm b 维生素A的氧化产物已介绍 维生素A3去水维生素A c 合成时的中间体 侧连有4个双键 应有种异构体 目前 包括维生素A在内 共发现有6种异构体 它们是 e 维生素A异构体 d 鲸醇维生素A醇的二聚体 没有生物活性 新维生素Aa 新维生素Ab 新维生素Ac 异维生素Aa 异维生素Ab 维生素A 1 维生素A的 max 2 3 分别在 1两侧 4 三个波长的选择方法 等波长差法 1 328nm 2 316nm 3 340nm 这两个波长分别在 1两侧12nm处 即 等吸光度法 1 325nm 2 310nm 3 334nm VA在这两个波长下的吸光度应该等于 1下的吸光度的 即 5 方法 Chp收载有2种方法 第一法 适用于酯式维生素A的测定 a 操作方法 最大吸收波长确认 max在326 329nm 第一法测定 max不在326 329nm 第二法测定 b 计算方法 计算吸收度比及比值差 首先要计算吸收度比值 然后计算吸收度的比值差 计算校正吸收度 吸收度校正公式 换算因数 定义 每一个数值所相当的效价 1IU 0 344 g全反式维生素A醋酸酯 1g的维生素A醋酸酯就相当于 维生素A醋酸酯 练习题 维生素AD胶丸中维生素A的含量测定已知 平均胶丸重为0 0815g维生素A的标示量为10000IU 丸取样 求 维生素A的标示百分含量 测定数据如下表 首先要求样品的 根据比尔定律 A为测得吸收度or校正吸收度 首先计算吸收度比值和吸收度比值差 填于上表 由此可知 应该用测得的328nm处的吸收度计算 然后计算校正吸收度与未校正吸收度相差的百分数 由结果知 需计算校正吸收度 所以 维生素A的标示含量 这样 第二法 皂化法 消除植物油干扰 适合VA醇 b 在300 310 325和334nm处测定吸收度 找出 maxc 计算d 校正公式A325 校 6 815A325 2 555A310 4 260A334e 判断 5 注意事项 1 VA遇光易氧化变质 操作应半暗室中快速进行 所用试剂不得含氧化性物质 以防VA紫外线或氧化性物质破坏 2 用三校正法测定时 一点在 max处 其余两点均为吸收曲线的上升和下降陡坡处 对波长的正确性要求严格 340nm处 若波长误差 0 5nm 可影响结果 3 1 2 07 所以测定时所用仪器的波长读数应注意 必要时应作标准 维生素A醋酸酯胶丸含量测定 取内容物39 1mg 加环己烷溶解并稀释成100ml 在下列五个波长处测得吸收度A值如下 已知 平均胶丸内容物重为0 08736g 维生素A的标示量为3000IU 丸试求 维生素A的标示百分含量 维生素A醋酸酯胶丸的含量测定 取内容物W 加环己烷溶解并稀释至10ml 摇匀 精密量取0 1ml 再加环己烷稀释至10ml 使其浓度为9 15IU ml 已知内容物平均重量为80 0mg 每丸标示量为10000IU 试计算取样量 W 的范围是多少 第二节维生素E的分析 名称 消旋 生育酚醋酸酯母核 苯骈二氢吡喃衍生物苯环上有一乙酰化的酚羟基侧链 脂肪烷烃 一 化学结构与性质 二 鉴别试验1 硝酸反应 本品 无水乙醇溶解 加硝酸 75 加热约15分钟 显橙红色 2 水解后氧化反应 本品 在碱性条件下水解 得 生育酚 在联吡啶和三氯化铁试液的作用下 反应产生血红色配离子 3 UV吸收 VE的0 01 无水乙醇液 max 284nm min 254nm 三 杂质检查检查游离生育酚 ChP2000P798取0 1g样品 按铈量法用Ce SO4 2 0 01mol L 滴定 以二苯胺为指示剂 消耗Ce SO4 2液不得超过1 0ml 一 铈量法1 原理 VE用硫酸加热回流 水解成生育酚 用硫酸铈定量地氧化为对一生育醌 过量的硫酸铈氧化二苯胺指示剂而指示滴定终点 终点 亮黄 灰紫空白试验 四 含量测定 2 反应条件 1 VE在H2SO4酸性条件下水解为宜 碱性溶液中游离生育酚易被氧化 Ce SO4 2液滴定在酸性溶液中进行 如在碱性中会生成碱式盐而影响测定 2 Ce SO4 2溶于酸水溶液 不溶于醇 生育酚溶于酸而不溶于水 滴定过程中应有一定浓度的乙醇 3 本法适用于纯度高的VE供试品 二 气相色谱法 Chp20001 色谱条件及系统适应性试验色谱柱 2m 4mmI D 硼硅玻璃柱 内装硅藻土 80 100目 固定相 硅酮 OV 17 涂布浓度2 载气 N2 流速 含2 固定相 以18 20分钟为宜 含5 固定相 以30 32分钟为宜 柱温 265 内标 正三十二烷检测器 FID 氢火焰离子化检测器 性能要求 理论塔板数按VE峰计算应不低于500 VE峰与内标物质峰的分离度应大于2 2 溶液配制 内标溶液 正三十二烷的环己烷溶液 1 0mg ml 对照溶液 对照品溶解于内标溶液中 1mg ml 供试品溶液 供试品约50mg 用内标溶液 溶解并稀释至50ml 4 供试品测定mg F Ax Ms AsAx 供试品峰面积F 校正因子As 内标物的峰面积5 特点 1 简便快速 专属性强 适用于VE VE制剂及多种维生素制剂中VE的测定 2 需要特殊仪器 三 高效液相色谱法日本药局方 JP13 色谱条件 柱 ODS流动相 甲醇 水 49 1 检测波长 292nm对照品法定量 第三节维生素B1的分析 一 化学结构与性质1 结构 氯化3 4 氨基 2 甲基嘧啶 5 甲基 5 2 羟乙基 4 甲基噻唑的盐酸盐 2 结构特点 a 氨基嘧啶 次甲基 噻唑环季铵化合物 b 碱性基团 嘧啶环上的氨基可与酸成盐噻唑环上的季铵 3 性质 硫色素反应VB1噻唑环在碱性条件下可被铁氰化钾K3Fe CN 6等一些氧化剂氧化后 与嘧啶环上的氨基缩合成具有荧光的硫色素 沉淀反应VB1的含氮杂环 能和生物碱沉淀试剂反应产生沉淀 如 VB1与硅钨酸反应可生成组成一定的沉淀 重量法测定VB1含量 硫胺显碱性具有两个碱性基团 噻唑环上的季铵 嘧啶环上的氨基可以和酸成盐 如 盐酸硫胺 硝酸硫胺 加碱分解后与醋酸铅反应VB1与NaOH试液一起加热 分解产生NaS 可与PbAc2反应生成PbS的黑色沉淀 维生素B1的水溶液显氯化物的特征反应 二 鉴别试验 1 硫色素荧光反应 VB1专属反应 用于鉴别和含量测定 2 沉淀反应 可与某些生物碱沉淀试剂生成组成恒定的沉淀如 与碘化汞钾产生淡黄色沉淀与碘生成红色沉淀与硅钨酸生成白色沉淀与苦味酸生成扇形白色结晶 三 含量测定非水滴定法 ChP所用方法 硅钨酸重量法银量法硫色素荧光法紫外分光光度法比色法络合滴定法 一 非水溶液滴定法 1 原理 VB1分子中含有已成盐的伯胺和季铵基团 在非水溶液中 在醋酸汞存在下 均可被高氯酸滴定 2 方法 溶剂 冰醋酸指示剂 喹哪定红 亚甲蓝混合指示液滴定剂 高氯酸醋酸汞 终点 天蓝色空白校正 T 16 86mg ml 二 硅钨酸重量法 2VB1 硅钨酸 白色沉淀 4HCl 1 原理 VB1在酸性溶液中与硅钨酸作用产生沉淀 根据沉淀的重量和供试品的重量即可计算其含量 2 计算 2VB1的分子量为2 337 27沉淀的分子量为3479 22换算因数 0 1939 含义 1g沉淀相当于0 1939gVB1 3 测定方法 4 实验条件 1 取样量 应在50mg左右 不得少于25mg 2 加入盐酸的目的 易于过滤 酸量不足 沉淀的颗粒过细 酸量过多 无太大影响 3 硅钨酸的用量 硅钨酸 VB1 8 1用量不足 导致结果偏低 4 干燥温度 80 干燥3hr 至恒重 沉淀含4分子结晶水 换算因数为0 1939 5 硅钨酸的加入速度用滴管一滴一滴加入 纯度高快加 纯度低慢加 防止沉淀表面吸附的杂质来不及离开而被沉淀包围 6 煮沸时间2 5min为宜 使沉淀颗粒大 利于过滤洗涤 7 沉淀的洗涤用热稀盐酸洗涤 洗涤液用量不得多于50ml 否则 沉淀会部分溶解 8 洗器用4号垂熔玻璃漏斗为宜 4 重量法特点 1 比较准确 灵敏 2 方法简便 不需要特殊仪器 3 恒重比较费时间 第四章维生素C的分析一 化学结构 结构特点 维生素C分子中具有2个手性C原子 具有4种光学异构体 其中生理活性最强的是L 抗坏血酸 D 异抗坏血酸 L 异抗坏血酸 L 抗坏血酸 D 抗坏血酸 具有内酯结构 碱性下可水解 具有烯二醇基 还原性 能够被氧化成去氢抗坏血酸 酸性 能与碱成盐 二 性质与鉴别试验1 酸性烯二醇结构 酸性 C3 OH pKa 4 17 共轭效应 C2 OH pKa 11 57 邻位羰基 一元酸 能与NaHCO3作用生成钠盐 2 还原性烯二醇基 还原性 如 3 水解反应 L 二酮古罗糖酸 无生物活性 4 荧光反应 5 糖的性质VC的结构很象糖结构 具有糖的性质 这个反应的摩尔比是1 2 三 含量测定 1 碘量法 a 原理 b 操作 终点颜色 无色 蓝色1ml0 1mol L碘液1ml 8 806mgC6H8O6 c 讨论 反应条件 酸性使VC在空气中氧化速度减慢 溶剂 新沸放冷的水 减少水中溶解氧的影响 还原性物质的影响及排除 VC注射液中常加有亚硫酸盐如NaHSO3作为抗氧剂 排除 加入丙酮或甲醛 2 2 6 二氯吲哚酚滴定法原理 在酸性下氧化型是红色的 还原型是无色的酸性下直接用2 6 二氯吲哚酚滴定 用滴定剂自身的颜色变化指示终点 不需要另外的指示剂 所以 终点的颜色是溶液由无色变为红色 氧化型 红色 还原型 无色