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思考题生物大分子物质的制备简述生化分离方法与一般化学分离法相比的特点?特点：与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有其特殊性：（1） 生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至及几千种化合物。还有很多化合物未知，有待人们研究和开发。（2） 有的生物大分子在分离过程中还在不断的代谢，所以生物大分子的分离纯化方法差别极大，想找到一种适合各种不同类生物大分子分离制备的标准方法是不可能的。（3） 许多生物大分子在生物材料中的含量甚微。分离纯化的步骤繁多，流程又长，有的目的产物要经过十几步，几十步的操作才能达到所需纯度的要求。（4） 生化分离制备几乎都在溶液中进行，影响因素很多，经验性较强。（5） 许多具有生物活性的物质一旦离开活体，很容易变形破坏，因此常选用比较温和的条件。生物材料选择的一般原则有哪些？生物材料选择的一般原则是:制备生物大分子，首先要根据目的选择合适的生物材料。材料选择的一般原则是，有效成分（即欲提取的物质）含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低等。但在实际工作中，则只须考虑材料的选择符合实验预定的目标要求即可。材料选定后要尽可能保持新鲜，尽快加工处理。生物材料如暂不提取应冷冻保存。常用于细胞破碎方法可分为哪些类型？简述细胞破碎的目的意义。细胞的破碎方法可分为：机械法，包括（1）捣碎法（2）研磨法（3）匀浆法物理法，包括（1）反复冻融法（2）超声波处理法（3）压榨法化学与生物化学方法，包括（1）酶解法（2）化学法目的意义：除了某些细胞外的多肽激素和某些蛋白质与酶之外，对于细胞内或多细胞生物组织中的各种生物大分子的分离纯化，都需要事先将细胞和组织破碎，使生物大分子充分释放到溶液中，并不丢失生物活性。不同的生物体或同一生物体不同部位的组织，其组织破碎的难易不一，使用的方法也不相同。何谓提取？影响提取有效成分的因素有哪些?提取定义：提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂（溶液）处理原料，使欲分离物质充分溶解到溶剂（溶液）中的过程，也称为抽提。常用稀盐溶液、缓冲溶液和有机溶剂等来提取生物大分子。影响提取有效成分的因素：（1）溶液（溶剂）的性质（2）离子强度（3）PH（4）温度（5）防止酶的降解作用简述透析法的原理及应用原理：透析是利用小分子能通过，而大分子不能通过半透膜的原理把它们分开而除去小分子杂质的一种重要手段。应用：透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。在生物大分子的制备中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。常用的浓缩方法有哪些，试简述其原理?浓缩的方法有：（1） 透析法：把装抽提液的透析袋埋在吸水力强的聚乙二醇（PEG）或甘油中，10ml抽提液可在1h内浓缩到几乎无水的程度。（2） 沉淀法：在抽提液中加入适量的中性盐或有机溶剂使有效成分变为沉淀。（3） 吸附法：将干葡聚糖凝胶G25(或吸水棒）加入抽提液中，两者比例为1:5。由于凝胶吸水之故，抽提液的体积可缩小三倍左右，回收蛋白质量约80%。冷冻干燥的原理及优点原理：冷冻干燥是先将生物大分子的水溶液冰冻，然后在低温和高真空下使冰升华，留下固体干粉。优点：（1）由于是由冰冻状态直接升华为气态，所以样品不起泡、不暴沸（2）得到的干燥样品不粘壁、易取出。（3）冻干后的样品是疏松的粉末，易溶于水。什么是沉淀法，沉淀蛋白质的几种主要方法的原理及应用沉淀法：利用某种试剂使生物大分子沉淀，但不影响大分子结构的方法。主要方法：（1） 中性盐沉淀（盐析法）：中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以在加入大量中性盐后，其夺走了水分子，破坏了水膜。同时又中和了电荷，破坏亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。应用：除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。盐析法应用最广的还是在蛋白质领域。（2） 有机溶剂沉淀法：降低了水溶液的介电常数，减小了溶剂的极性。同时削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用，从而导致蛋白质溶解度降低而沉淀。除此以外，使带电溶质分子更易互相吸引而凝集，破坏了蛋白质的水化膜，从而发生沉淀。应用：生化制备。（3） 选择性变性沉淀法：利用蛋白质、酶与核酸等生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选择一定的条件使杂蛋白等非目的物质变性沉淀而得到提纯，称为选择性变性沉淀法。应用:通常用于生物大分子分离纯化的初期，是分离纯化流程中附带进行的一个分离纯化步骤。（4） 等电点沉淀法：等电点沉淀法是利用具有不同等电点的两性电解质在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。应用：此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。（5）有机聚合物沉淀硫酸铵沉淀蛋白质的原理是什么？使用硫酸铵应注意什么？为什么要防止局部浓度过高？硫酸铵沉淀蛋白质的原理：硫酸铵破坏蛋白质的水化膜，中和蛋白质电荷，破坏了胶体，从而形成沉淀。注意事项：纯度要高，否则夹带的杂质会使硫酸铵的浓度不准确，甚至引起蛋白质和酶的变性；添加硫酸铵后，要使其充分溶解，至少放置30min以上，待蛋白质沉淀完全，然后将沉淀分离。原因：防止蛋白质共沉。提取生物活性物质时，活性保护性措施有哪些？提取一些具有生理活性的物质时，除了考虑被提取物溶解度外，还应考虑被提取物活性的保护。对于一些生物大分子如蛋白质、酶和核酸来说，主要措施有如下几点：（1）采用缓冲系统；（2）加入保护剂；（3）抑制水解酶的破坏；（4）其它一些特殊要求的保护措施。生物大分子的保存需注意哪些问题？空气 温度 水分 光线 样品pH 时间生物大分子的制备分为哪几个阶段，包括哪些方法和技术？生物大分子的制备通常需经前处理、粗分级、细分级三个阶段。前处理包括材料的选择、细胞的破碎和提取等步骤。粗分级，即早期分离纯化。通常用盐析、等电点沉淀、超滤、有机溶剂分级等简便、处理量大的方法从混合液中除去大量杂质，得到浓缩溶液。细分级，即后期分离纯化。选用分辨率高的方法进一步提纯，如经过凝胶过滤、吸附层析、离子交换层析、亲和层析、HPLC以及凝胶电泳、等电点聚焦电泳等。简述生物活性物质分离纯化方法的主要原理。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。综合评价生物大分子分离纯化方案设计的好坏应从哪些方面进行？比活性（活性单位数/毫克蛋白）、 纯化倍数（每步的比活性/粗抽提液的比活性）、 收得率（每步的总活性/粗抽提液总活性*100%）层析技术根据分离原理不同，层析技术可以分为哪几种，其基本原理分别是什么?根据分离原理不用，可分为：吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。吸附层析：是以吸附剂为固定相，根据待分离物质与吸附剂之间吸附力不同而达到分离的层析技术。分配层析：是根据物质在两互不相溶的溶剂系统中，分配系数不同而达到分离的一种层析技术。凝胶过滤层析：是以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据物质在凝胶颗粒的微孔中扩散的速度进行分离，大分子移动的速度快，先被洗脱出来而小分子物质移动的速度慢，后被洗脱出来。离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有不同的静电力而将它们分离。亲和层析：是根据生物大分子和配体之间的特异性亲和力（如酶与抑制剂、抗体和抗原、激素和受体等），将某种配体连接在载体中作为固定相。固定相的配基与生物分子间的特殊生物亲和能力不同进行相互分离的技术。柱层析的基本操作包括哪些步骤?（1）装柱（2）层析柱的平衡（3）加样（4）洗脱（5）分离物质的收集、鉴定及保存（6）基质的再生离子交换层析的基木原理及一般操作原理：基于各种带电荷物质与交换剂的亲和力差异，即物质的电荷性、极性、与离子交换基团的交换能力差异，通过控制条件将它们分离。一般操作：离子交换剂的带电基团吸附溶液中相反电荷的物质，被吸附的物质随后与带相同类电荷的其他离子所置换而洗脱。离子交换剂有哪几部分组成？何为阳离子和阴离子交换剂?3部分，化学合成的树脂类 纤维素 凝胶引入带负电荷的解离基团称为阳离子交换剂，引入带正电荷解离基团称为阴离子交换剂。简述常用离子交换剂分类，选择离子交换剂的一般原则有哪些？3部分，化学合成的树脂类 纤维素 凝胶选择离子交换剂的一般原则：（1） 选择阴离子或阳离子交换剂，取决于被分离物质所带的电荷性质。如被分离物质带正电，则用阳离子交换剂，如被分离物质带负电，则用阴离子交换剂。（2） 交换剂的基质是疏水性还是亲水性，对被分离的物质有不同的作用性质，因此对被分离物质的稳定性和分离效果均有影响。（3） 强型离子交换剂使用的PH范围很广,所以常用它来制备去离子水和分离一些在极端PH溶液中解离且较稳定的物质。（4） 选择离子交换剂，取决于交换剂对各种被分离物质的结合力。离子交换层析洗脱方法有哪些？并说出各种方法的洗脱原理。增加洗脱液的离子强度、改变洗脱液的pH。试述公式Ve =V0 + Kd Vi 各字母的物理意义。公式Ve=V0+KdVi中Ve 代表被分离组分的流经体积，V0代表外水体积，Vi 代表内水体积。Kd 称作“排阻系数” 或“分配系数”， 它反映了物质分子进入凝胶颗粒的程度。对一定种类规格的凝胶，物质的Kd 值为该物质的特征常数。排阻系数：当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。0Kd 1时，洗脱体积V e=Vo+KdVi，为部分渗入。凝胶过滤的基本原理是什么?根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。凝胶层析的应用主要有哪些？并说明其原理。分离生物大分子 浓缩和脱盐 除热原物质 蛋白质分子量测定凝胶过滤层析：是以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据物质在凝胶颗粒的微孔中扩散的速度进行分离，大分子移动的速度快，先被洗脱出来而小分子物质移动的速度慢，后被洗脱出来。从而将大分子和小分子分开。亲和层析的原理是什么？主要特点是什么？亲和层析原理：根据流动相中的生物大分子与固定相表面偶联的特异性配基发生亲和作用，有选择性吸附溶液中的溶质而进行的层析分离方法。主要特点：（1）待分离物质与配基专一性地结合，分辨率高，操作简单，通过一次操作即可得到较高纯度的分离物质（2）具有浓缩作用，可以从含量很低的溶液中得出浓度很高的样品，有的纯化倍数达几千倍。（3）利用生物学的特异性进行分离，所以分离条件比较温和，能够很好地保持样品原有的生物学性质。电泳技术何谓电泳？电泳的基本原理是什么？影响带电颖粒在电场中泳动速度的因子有哪些?电泳指带电粒子在电场的作用下发生迁移的现象。基本原理：混合物中个组分所带电荷性质、数量以及相对分子质量各不相同，使在同一电场作用下，各组分的泳动方向和速度也各有差异，所以在一定时间内，它们移动距离不同，从而达到分离鉴定目的。影响其泳动速度的因子：（1）待分离生物大分子的性质 （2）电场强度 （3）缓冲液性质 （4）电渗作用 （5）支持介质的筛孔电泳技术通常可分为哪几种类型？常用的凝胶电泳技术有哪些？电泳技术可分为薄膜类和凝胶类。常用的凝胶电泳技术有：聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶醋酸纤维素薄膜电泳的优缺点及应用优点：（1）电泳后区带界限清晰（2）通电时间较短（20min-1h）（3）它对各种蛋白质都几乎完全不吸附，因此无拖尾现象。（4）对染料也没有吸附，因此不结合的染料能完全洗脱，无样品处几乎完全无色。（5）它的电渗作用虽高但很均一，不影响样品的分离效果。采用的是较低电流。简述不连续电泳样品压缩成层的原理。电泳缓冲液主要存在三种阴离子，Cl-、甘氨酸阴离子以及蛋白质-SDS复合物，在浓缩胶的pH下，甘氨酸少量电离，其电泳迁移率最小，Cl-电泳迁移率最大。在电场作用下，Cl-最初的迁移速度最快，在Cl-后形成低电导区，从而产生较高的电场强度，甘氨酸阴离子和蛋白质-SDS加速移动。达到稳定状态后，Cl-和甘氨酸之间形成稳定移动的界面。简述连续梯度电泳的原理及优点原理：样品的最终迁移位置仅取决于分子自身的大小，而与样品分子的电荷密度无关。样品混合物中分子质量大小不同的组分，电泳后将依分子质量大小停留在不同的凝胶孔径层次中形成相应的区带。优点：（1）具有使样品中各个组分浓缩的作用，稀释的样品可以分次上样，不会影响最终分离效果。（2）可提供更清晰的谱带，适于纯度分析。（3）可在一张胶片上同时测定分子质量分布范围相当大的多种蛋白质的分子质量。（4）可以测定天然状态蛋白质的分子质量，这对研究寡聚蛋白是相当有用的。蛋白质在不连续PAGE中实现分离的基本原理是什么？为什么不连续系统或连续系统的聚丙烯酸胺凝胶电泳比琼脂电泳分辨率高?原理：由于分离胶的孔径较小，分子量大小或分子形状不同的蛋白质通过分离胶时，所受阻滞的程度不同，因而迁移率不同而被分离。样品通过一定孔径的凝胶时，受阻滞的程度不同，小分子走在前面，大分子走在后面，各种蛋白质按分子大小顺序排列成相应的区带。原因：由于缓冲液离子成分、带电颗粒在电场作用下，靠电荷及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应。简述SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。原理：SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。SDS-PAGE测定蛋白分子量的原理是什么？原理：SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当相对分子质量在1.5*1042*105之间时，蛋白质的迁移率和相对分子质量的对数呈线性关系。在不连续体系SDS-PAGE中，当分离胶加完后，雪灾其上加一层谁，为什么？分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,各起什么作用？加水原因：隔绝空气，使分离胶在凝固收缩的时候界面保持平滑。作用：AP为催化剂,提供自由基引发聚合、TEMED为加速剂,促凝作用,加速聚丙烯酰胺的凝固。琼脂糖凝胶电泳的原理，优点及应用原理：琼脂糖凝胶具有网络结构，直接参与带电颗粒的分离过程。在电泳中，物质分子通过空隙时会受到阻力，大分子受到的阻力比小分子大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅依赖于静电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小。优点：分辨率高、重复性好，区带易染色、洗脱和定量以及干膜可以长期保存。应用：核酸、蛋白质的分离鉴定简述等电聚焦电泳的基本原理基本原理：根据等电点（pI)不同使目的蛋白分离。电泳时，不同等电点的蛋白会聚集在其相应的等电点条带。
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