做好免疫组化染色必须注意的问题.doc

做好免疫组化染色必须注意的问题一、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。在免疫组化最后结果的判断时，常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象，经多方研究认为，它是一种假性非特异性的染色。因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散，肿瘤细胞无限制的生长和生长过速，导致肿瘤中间部分组织血液供给困难，造成缺血坏死，坏死细胞中的抗原由于机体的作用，可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质，这是抗原发生弥散的一种方式。另一种抗原弥散的方式就是，由于组织没有及时的固定所引起的。离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散，这是一非常普通的常识，但要做好却是极不容易。标本从外科切除到浸入固定液需要经过一段时间，在这段时间里，有的抗原就可以发生扩散。虽然已浸入了固定液，但标本较大，固定液的量又不足，当然由于固定液的渗透需要时间，当渗入到组织之中时，中间的细胞已发生了变化，抗原也随着发生扩散，这种现象在产酶多的器官是比较明显的，如胃癌，当切除后标本较大，虽然在手术室期间已放入了固定液，但固定液要透过肌层达到胃粘膜面起码需要几个小时的时间，当固定液发挥作用时，组织已经发生变化。因此，这了达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。二、组织脱水必须彻底干净组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操作，造成年人力物力的浪费，造成病理报告的延期发出等。因此，对取材的要求是除了要求要有艺术性外，即平整、外观好看，还要求适中。三、切片必须完整、均匀、平展、无邹折应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡，无邹折，这样有利在染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。如果切片不平展，免疫组化染色后，可出现染色不均匀的现象，颜色深浅不一，不平。如果切片有汽泡切片在烘烤时，由于汽泡的破裂影响了汽泡周围的组织，在其周围可观察到深浅不一的染色。如果切片有邹折，免疫组化染色后，在邹折的地方有深浅不一的颜色，这是一种假阳性，容易引走混淆。四、切片的附贴必须牢固，必须使用合适的粘贴剂。免疫组织化学染色前的前期准备工作，就是必须对新的载玻片进行处理，新的载玻片表面看起来很干净，有人认为不需要进行任何的处理，都能够适合使用，这是一种错误的想法。新出厂的载玻片，表面复盖着开一层油脂样的物质，如果不加以处理，对切片的附贴是极为不利的。我们的做法是：新的载玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小时甚至过夜，然后取出，经自来水彻底冲洗后，浸入酒精中达2小时以上，取出擦干备用或烘干也可。然后再将载玻片浸入了氨基三乙氧基硅烷（3Aminopropyl triethoxy-silane）的稀释液（1：50用丙酮或无水乙醇稀释都可以）中硅化10分钟，后经无水乙醇洗2次，烘干即可使用。五、切片必须烘烤附贴牢固，既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片，又不至于破坏抗原。应用于免疫组化染色的切片。由于整个过程需经几个阶段的处理，如抗原修复时抗原修复液的沸腾且需持续十几分钟，PBS的反复冲洗，有的甚至于4冰箱中孵育达十几小时。因此，对切片的质量要求很高，尤其是切片的附贴程度。以往有人主张切片在60以下烘烤30-60分钟即可按此进行结果是切片掉片严重，切片松动率占100%。切片究竟烘烤多长时间才合适，既不脱片和适合各项要求，又不至于破坏抗原。几组实验诊断P173认为，切片在60的恒温干燥箱中烘烤2-5小时最为合适。这是因为：抗原可耐受如此的温度，病理科一般使用的石蜡，其熔点在60左右，组织浸蜡时，浸蜡箱中的温度，一般都调在65左右，组织在这样温度中要浸泡2小时以上，才能达到彻底地浸蜡。组织中的抗原已经受了65的温度考验，保存下来的抗原，都已具有耐热性。另外，经上述时间烘烤出来的切片，附贴牢固，抗原保存好，染色成功率达100%，保证了病理诊断的及时性和准确性。特需要注意的是，不管是应用于诊断的切片还是研究用的切片，烘烤后应尽快进行染色。如果切片切完后，迟迟不进行染色，存放于室温中或工作冰箱中，切片中的抗原将会随着时间的延长而逐渐消失，甚至出现假阴性。原则上是新鲜切片，即行染色，染多少张切多少张，这样才能尽可能的保存表达更多的抗原。六、切片脱蜡必须干净，否则将会影响免疫组化染色的最后结果。蜡不溶于水，不与其它的临床使用的抗体相融合。它只能靠特用的试剂，处理足够的时间，才能将其除去。如果脱蜡不干净，少许蜡存留于切片上，将会引起许多弊病，如染色不均匀，阳性物时隐时现，真假难辨，背景染色增加等。为了解决上述的问题，切片在染色前必须彻底脱蜡，目前用于脱蜡的试剂主要是二甲苯，因它脱蜡力强，脱蜡时间较短。较受使用者的青睐。脱蜡的时间要根据季节，室温和试剂的新鲜谋面是在不同。如果在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长。总之，操作时应根据不同的季节，不同的室温，不同的试剂来决定，脱蜡的时间，原则上是要彻底，干净，完全地脱去切片上的蜡。为了做到这一步，切片在脱蜡前的加温将有助于完成上述的要求。比如：当天切的切片，烧烤2小时后进行染色，切片带有温度进行脱蜡这将可加速脱蜡的过程，如果预先切好烤好的切片，在染色前，还必须对切片进行加温10-20分钟，然后再行脱蜡，这样脱蜡速度加快，效果魁伟更好。七、必须彻底抑制内源性过氧化物酶的活性，才能降低背景的染色。在各种组织中都含有很多的内源性过氧化物酶，尤其在红细胞，中性粒细胞，单核细胞嗜酸性细胞，出血的组织坏死的组织等等。含有这种酶的各细胞和组织如果在染色前不对其进行处理和抑制，它们将会在DAB底物的显色时，与HRP一样催化底样，使之显色，使之生成与阳性物一样的黄棕色，造成混乱。为止，在免疫组化染色前，都必须对内源性过氧化物酶进行抑制。当然，对它们进行彻底的消除是不行的，因为抑制太厉害，对抗原也会有相同的抑制作用。氢在抑制内源性过氧化物酶时，也要注意对抗原的保护抑制也只能对它们中的大部分在DAB显色后，显示出淡黄*色，这就足以与真正阳性物的区别。抑制剂常用的是0.3%的H2O2，也可将其称为1%H2O2，因为市售的H2O2的浓度为30%，按其净含量则为0.3%，如果按其溶液的用量则为1%。关于H2O2的使用，有的使用是单纯的H2O2稀释溶，有的使用是H2O2甲醇混合物。根据实验，认为H2O2甲醇较适合于大多数的情况，因为除了H2O2外，甲醇对各种酶，都有钝化的作用，因此H2O2甲醇的双重作用效果较好。陈尚平等认为在多数情况中，用甲醇H2O2已经获得令人满意的结果。八、须适当合理地使用封闭试剂为了减少背景产生的非特异性染色，在免疫组化染色的过程中，在加入一抗孵育前，常常加入非免疫动物血清，以减少背景的染色，陈尚季等认为：抗体是高度的电荷分子，可能与带有相应电荷的组织成分无特异性地结合（如胶原）。由于这种非特异性结合，将导致标记的部分局部化（轭合物）和胶原的假阳性染色。要用一种不相干的抗体居先处理，可能减少和标记的抗体无特异性结合。以往，血清的使用有很多，如：小牛血清，马血清，山羊血清，绵羊血清，兔血清，浓度也有很多种，如：1%.2%.或1：5、1：10、和1:20.必须选择合适的抗体以及对作适当的保存和配制。九、选择合适的抗体至今为止，应用于临床的常用抗体有几十种，在这当中又可分为两种类型。1.浓缩型抗体根据近几年来使用的情况认为，它有许多优点，但也有许多不足之处：可作为各种疾病检测的常备抗体。在各单位的常规活检诊断中，有常见的病例，也有罕见的病例，尤其是后者，有时很长时间才遇到一例，这就给抗体的应用和备用提出了更高的要求，如除了常用的抗体外，还需备用一些较为罕见病例的抗体。这样才能解决临床的诊断问题，如临时购买，则需较长的时间，这样就会延误诊断。实践证明：浓缩型抗体，可作为常备检测抗体。当购买抗体后，根据检测病例的数量，在无菌的条件下，将抗体分成小包装，然后用蜡膜封起来，于30的低温冰箱中保存，临用时取出一支，用指温促其回升至室温，然后用PBS稀释即可使用，这种抗体可保存3年左右。成本低，价格较便宜。它与即用型的抗体相比较，价格要便宜好多，如以某公司2002年-2003年的CK为例，浓缩型的抗体0.1ml，价格260元，该抗体可稀释为5000ml，以每张切片所需抗体为50ul计，可标记100例，每例一抗体所需2.6元，而即用型抗体1.5ml，价格150元，可标记30例，每例一抗体需5元。需要稀释抗体，手续较为复杂。对于新购入的浓缩型的抗体，使用时必须将稀释为工作液，才能使用，对于从未用过的抗体，还必须实验其实际的稀释度，因为各种抗体，厂家都做了相应的稀释度的实验，但这是大概的稀释度，要使抗体真正适合于本单位的稀释度，就必须对抗体的稀释度进行实验，如1:100.1:75.1:50.1:25等，如果结果在1：50上是最佳结果，这就是最佳的稀释点，如果在这范围内找不出最佳稀释点，则应继续实验直到找出最佳稀释点为止。需要配置各型号的微量加样器，以利于量取精确的抗体量。需要具备一定的英语水平，因为浓缩型的抗体多为进口试剂，其使用书都以英文为主，其中涉入抗体的来源，适应让稀释对什么组织或细胞可起反应等。2.即用型抗体。近几年来，免疫组化技术应用的推广，即用型抗体的应用越来越受到人们的欢迎，根据几年来的使用，认为它有许多优点和不足：使用方便。对于初学者来说，它是一种最好的抗体，不管什么样的病例和切片，只要有抗体，不需要自己摸索稀释度，拿起试剂瓶一滴即可，极不方便。对于不具备或基本不懂免疫组化技术的人，只要按照说明书的方法使用，也能获得理想的结果。不需要配置多种昂贵的微量加样器。现今的微量加样器，如为进口货，贵者多达两千多元。而即用型抗体无需再行稀释，即买即用，无需配备其余器械。特别适合于基层单位。基层单位，无需多大的投资，就能开展免疫组化的工作，这对于提高诊断的准确率，极有好处。价格较浓缩型抗体贵。即用型抗体不可作为常备贮存抗体。即用型抗体，一般有效期为一年。如果用量大的单位，对于3ml一个包装的抗体，一年需要用几支，这对抗体来说，不会造成浪费。但如果为较小的单位，一年中标记的病例较少，购买抗体时也尽量选小包装的抗体，如1.5ml。如果碰上罕见的病例，有时一年也标记不了几例，这样就应采用浓缩的了。即用型的抗体，有效期为一年，但真正购买到的抗体使用期就不可能为一年，因为抗体从生产商到销售商的手里，需要一定的时间，如果运气好的话，你购买到的抗体，是刚交到销售商的手里，那么，使用的时间可能长些，但如果在销售商的手中滞留了一段时间，抗体的有效使用期就可能不会太长，五个月、六个月或者三个月。如果在有效的时间内不能使用完。稍为超过一些时间还可以，如果时间过长，就应当丢弃，因为会影响标记的质量。有人抱怨，刚买的抗体标记很好，后来就渐渐不好了。这是因为随着时间的延长，抗体的活性会逐渐失去生物活性，导致了标记质量的下降。（2） 抗体的适应症。在众多的抗体中，按它们的实际使用范围，把它们分为两个类：1.适合于冰冻切片，涂片，细胞培养片。2.适合于石蜡切片，冰冻切片，涂片和细胞培养片。（3）选择合适的单克隆或多克隆抗体。抗体除了分为上述的两个类外，从其克隆的高度讲，也有单克隆和多克隆之分。1.单克隆抗体，在目前临床常用的抗体当中，大部分都是单克隆抗体。这要归功于生物技术的不断提高。在早些时候，应用于临床的抗体，大多数为多克隆抗体。2.多克隆抗体，在临床应用的抗体中，还有少部分的抗体为多克隆抗体。（4）抗体的加入。这看似很简单的问题，如果处理不好也可导致不同的结果，如果应用自动免疫组织化学染色仪，将程序输入即可，如为手工操作，就必须注意以下的问题：1.当PBS冲洗完毕后，在加入抗体，如一抗，二抗或三抗。必须将存留于切片上的多余的PBS摔干，但不能让切片干涸，切片干涸，往往可产生非特异性染色，切片上PBS存留过多，将会稀释加入的抗体，影响加入抗体的浓度，同时也将影响最后的结果，如假阴性等。2.加入的抗体以一滴为佳。当擦干组织块周边多余的PBS后，切片保持着一定的湿润度，此时加入另外的抗体为最佳时候，滴入抗体以一滴50ml为好，加入后，轻微地摇匀地覆盖于切片上，使最后的结果稳定均衡，不至于有的地方有反应，有的地方无反应。3.切片没擦好将会影响加入抗体的质量，切片没冲洗干净，没擦试好，当加入抗体后，它可缩于切片的一边，此时你为了使加入的抗体能够完全地覆盖整个切片，便会使劲地加入抗体，此时的结果是，抗体依然滑向一边，或者完全露出，这不光没达到目的，还浪费抗体，正确的做法就是彻底地用PBS冲洗，摔干切片擦干切片周边的PBS，再滴入一滴抗体轻轻摇匀即可。（5）选择合适的孵育时间。第一抗体的孵育时间，有较多的使用范围，应用于临床检测抗体的孵育时间。一般室温下孵育在30-60分钟，120分钟，对于研究性质的抗体孵育时间，也可按照上述的时间，但也有人提出于4冰箱中过夜孵育，根据我们的经验一般不主张于4冰箱中过夜，原因是：1.长时间的孵育可以使一些非特异性的物质沉淀下来，或者被吸附，造成背景的染色。2.目前销售的抗体，纯度较高，特异性较强，不需要长时间的孵育，也能够结合得很好。3.长时间的孵育，较容易引起切片的脱落，造成染色的失败。4.长时间的孵育，不利于临床病理报告的发出。十、连接抗体的选用必须正确，否则可造成假阴性的现象。免疫组化染色方法较多，如ABC法，SP法和EV二步法等，如果使用的是SP法，或者ABC法，这时就必须要仔细地选择好连接抗体，第一抗体有单克和多克隆炎分，连接抗体则要根据选用的抗体来进行，例如：第一抗体选用的是单克隆鼠抗人*抗体，连接抗体也要选择相应的免抗鼠IgG，这样才能连接上（目前生产厂家已生产出混合型抗体，即既适合于单克隆抗体，也适合于多克隆抗体。使用者不用担心连接不上，随便使用都可，但如果没有订购混合型的试剂盒，就必须注意的型号，使之完全适合所选用的抗体。）孵育的时间可在10分钟，20分钟或者30分钟，一般在室温中进行，如果室温低于20以下，则可在37的孵育箱中进行。十一、复合物的使用及孵育时间的确定。各种方法有各自的复合物，如ABC法，复合物是卵白素和生物素结合的复合物，再带有HRP，SP法，（LsAB法）的复合物是链雪菌素蛋白复合物，再带有HRP，EV二步法的复合物则是二抗和三抗连接在一起的复合物，再带上HRP，除此之外，根据水解底物的不同，可产生不同的颜色，例如：带有HRP的酶，水解的底物一般为DAB产生黄棕色，带AP的酶，水解的底物一般为AEC产生红色。十二、PBS的冲洗免疫组化的染色过程，除了前面的处理和加入的抗体外，都在PBS的冲冲洗洗中度过，PBS冲洗的正确与否，也是导致最后结果的关键。1.单独冲洗，防止交叉反应造成污染。临床上每天检测的病例很多，所用的抗体种类及项目也多，如果在加入一抗孵育完后，将它们在一个缸内洗，这样就会造成交叉污染，影响最后的结果。正确的做法是单独地进行冲洗，冲洗的PBS为一次性，保证切片没有相互交叉污染的机会。2.温柔冲洗，防止切片的脱落。冲洗切片，取出切片，将PBS从上轻轻地冲洗，让PBS自上而下流下来，不要拿起切片将PBS对准切片冲洗，这样由于冲出的PBS有一定的冲击力，很容易使切片周边引起松动，导致切片的脱落。3.冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。冲洗切片有人提出用微振荡器振染，振下未结合的各种物，使之不产生背景，此种做法一是浪费时间，二是很容易导致切片的脱落。切片的冲洗据实践认为，用一小烧杯柔和地于切片上冲洗，就能彻底冲洗去未结合的物质，无需附加其它条件，冲洗好于切片上再注入PBS，持续2分钟左右就完全足够了。4.PBS的PH和离子强度的使用和要求。刘彦仿指出：中性及弱硷性条件（PH78）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。免疫组化P56我们目前常用的PBS的PH在7.4-7.6浓度是0.01M，根据本室十几年来的使用情况，认为该溶液价格便宜配制方面，使用效果好。5.常用试剂的配制和使用。在免疫组织化学的染色过程中，用得最多的试剂就是缓冲液，因为切片在整个染色中，抗体的加，换，切片的冲洗，DAB的配制都离不开缓冲液。可见缓冲液在整个染色中都起至关键的作用，缓冲液的过酸或偏碱，都将影响染色的结果。下面将介绍有关方面的内容：（1）缓冲液的配制1.磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer solution.PBS）液：0.2MNa H2PO4贮存液（PH7.6）取一个具500ml的容量瓶，称量15.60g NaH2PO412H2O倒入瓶中，加入少量蒸馏水使劲摇晃，直至溶解，加入蒸馏水凑足500ml。放于4冰箱保存，配制时应注意的事项：在配制时，要先确定NaH2PO4的用量，因为该试剂有许多种类形，它们所含的水分子量不一样，因而它们的用量也不一样。如NaH2PO4含单个水分子时，配制时要称取13.80g，而当含有2个水分子时，则需要称取15.60g。配制时根据要求选取蒸馏水。因为蒸馏水有数种，单蒸馏水，双蒸馏水，玻璃蒸馏水，去离子水。如没特别要求，选用一般的蒸馏水配制则可。装缓冲液的瓶子须用玻璃浸洗液泡洗过，以防污染，导致溶液中有雪菌生长。液：0.2M NaHPO4贮存液(HP7.6)取500ml的容量瓶，称好17.91g NaHPO412H2O,倒入瓶中，边加水边搅拌，直至完全溶解再凑足500ml，贮存于4冰箱。注意事项：该试剂也应注意有多种不同的含水分子量。该贮存液久放后可出现结晶。每次使用前，先取出回至室温，摇晃其结晶溶解，也可用微波炉促其快速溶解，然后再用。0.01M PBS工作液的配制：取一2000ml的容量瓶一个，装入已称好的NaCt18g，加入少量蒸馏水让其彻底溶解，再加入 液13ml，液87ml，加蒸馏水凑足2000ml，即可使用，即可使用该溶液在室温下可保存3-4周，但以新配为佳。PBS工作液配制完毕后，都要测其PH值，如果偏酸，可用氢氧化钠来调试，如果偏碱可用HCl调试，测试有如下n种方法：PH测试笔测试，这是一种简便、易行、结果较为准确的测试方法。当配制完PBS后，取一小杯，倒入配好的PBS，插入测试笔，打开开关，小屏幕上将可出现测出的PH结果。PH如果7.6不足，小量的可用0.2M Na2HPO4调校，大量的可用氢氧化钠调校。PH如果高于7.6，小量的用0.2M NaH2PO4调校，大量的可用HCL来调校。用试纸来测试：PH试纸有两种，一种为广泛PH试纸，范围在1-14，另一种是精密试纸有各种各样的范围。但是，作为冲洗切片用的PBS，其精确度不需要十分精确，如配PH7.6时，测试时在PH7.5或7.7，都可使用。试纸测试PH值，停靠其反应的颜色来确定，十分简便，一般的试剂都可用它来测试。仪器测试：对于要求较高，需较准确的PH值，须彩用仪器测试。1.Tris缓冲溶液(Tris buffer solution,TBS)1N HCL ，浓HCL(双重1.19)8.3ml，先取50ml蒸馏水，加入HCL再加水到100ml。0.5M Tris-HCL缓冲液(PH7.6)取Tris(羟甲基氨基甲烷)6.57g，加入少许的蒸馏水搅拌，直至溶解，再加入1N HCL42ml，然后用蒸馏水凑足100ml，于4冰箱保存。临用时，将上述溶液10稀释倍，即为0.05M工作液。注意事项：配制1N HCL时，如果大量配制，HCL入水时可产生很大的热量，对的所用的玻璃器皿应特别小心，以防突然产热而使玻璃器皿爆裂。调校PH值时，可参考上述的三种方法