miRNA细胞转染(Entranster)步骤.doc

下面以Entranster-R4000试剂为例，说一下miRNA转染步骤（24孔板）1.提前1天细胞种植 贴壁细胞：提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞汇合度（Confluence）在30左右为宜，转染前全培养基总量为0.45ml。 悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6105，那么就用2105的细胞进行转染。 2.转染过程 取0.67ug(50pmol)的miRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为25l。 注意：无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。 取1ul的EntransterTM-R4000，然后加入24ul无血清稀释液体，充分混匀，制成EntransterTM-R4000稀释液，终体积为25l。室温静置5分钟。 将EntransterTM-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合（可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上）混合，室温静置15分钟。转染复合物制备完成。 将50l转染复合物滴加到有0.45ml全培养基（可含10%血清和抗生素）的细胞上，前后移动培养皿，混合均匀。 注意：对本试剂，采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。 转染后6小时观察细胞状态，如状态良好可不必更换培养基，继续培养24-96小时得到结果。