gg动物细胞培养和核移植技术.ppt

动物细胞工程 动物细胞培养 动物细胞融合 单克隆抗体技术 动物细胞核移植 动物细胞工程常用技术 复习 植物细胞工程中常用的技术 植物组织培养和植物体细胞杂交 其他动物细胞工程技术的基础 如果一个大面积烧伤的病人 自体皮肤有限 其他渠道的皮肤来源不足 如何才能获得大量的自体健康皮肤 人耳鼠 人耳鼠 再出风头2001年 一只特别的活老鼠在北京引起轰动 这是有着一对红眼睛的 尾巴长长的 浑身没毛的小白鼠 值得一提的是 这只小白鼠的背上 竟长着一只几乎与身子一般大小的 人耳 这只老鼠背上的 人耳 是由上海市第九人民医院副院长 整复外科主任曹谊林教授利用组织工程技术复制出来的 在京展出的数天 尽管门票高达20元 但还是有将近20万人 心甘情愿地掏钱一睹 人耳鼠 的风采 人耳鼠的出现 透露了怎样的信息 动物细胞培养和核移植技术 一 动物细胞培养 动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织 将它分散成单个细胞 然后 放在适宜的培养基中 让这些细胞生长和增殖 细胞增殖 2 原理 1 概念 3 过程 复习 植物组织培养 在无菌和人工控制的条件下 将离体的植物器官 组织 细胞 培养在人工控制的培养基上 给予适宜的培养条件 诱导其产生愈伤组织 丛芽 最终形成完整的植株 过程 幼龄动物 取动物器官和组织 剪碎组织 胰蛋白酶处理 细胞培养 单个细胞 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础 3 过程 剪碎的动物组织块 细胞悬浮液 胰蛋白酶 10代细胞 原代培养 传代培养 无限传代 单个细胞 加培养液 动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质 将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官 传代培养 将原代细胞从培养瓶中取出 配制成细胞悬浮液 分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养 称为传代培养 原代培养 从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞 分装前的细胞培养 水解弹性纤维 4 动物细胞生长特性 悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上 称为细胞贴壁 细胞贴壁 培养瓶或培养皿的内表面光滑 无毒 易于贴附 要求 接触抑制 细胞在贴壁生长过程中 随着细胞分裂 数量不断增加 最后形成一个单层 此时细胞间相互接触 细胞分裂和生长停止 数量不再增加 接触抑制 细胞悬浮液 胰蛋白酶 10代细胞 原代培养 传代培养 无限传代 单个细胞 加培养液 剪碎的动物组织块 传代培养的细胞一般传至10代左右细胞生长停滞 大部分细胞衰老死亡 少数细胞存活到40 50代 这种传代细胞为细胞株 细胞株 细胞系 细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态 只有部分细胞由于遗传物质的改变 使其在培养条件下可以无限制传代 这种传代细胞为细胞系 细胞系的遗传物质改变 具有癌细胞的特点 失去接触抑制 容易传代培养 动物胚胎或幼龄动物的组织或器官分裂旺盛 分化程度低 易培养 P44思考 1 用胰蛋白酶分散细胞 由此可说明细胞间的物质主要是什么成分 2 胰蛋白酶能将细胞消化掉吗 那将动物组织分散成单个细胞时要注意什么问题呢 3 能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗 为什么 主要是蛋白质 胶原蛋白等 能 应注意时间的控制 不能 因为动物细胞培养适宜的PH为7 2 7 4 此环境下胃蛋白酶 2 0 没有活性 而胰蛋白酶 7 2 8 4 的活性较高 多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中 根据你所学的内环境的知识 讨论以下问题 1 体外培养细胞时需要提供哪些物质 2 体外培养的细胞需要什么样的环境条件 5 动物细胞培养的条件 P46 讨论 充足的营养供给 适宜的温度 适宜的pH和气体环境 无菌 无毒的环境 1 无菌 无毒的环境2 营养 与体内基本相同 3 温度和PH4 气体环境 保证细胞顺利的生长增殖 无菌处理 添加一定量的抗生素 定期更换培养液 葡萄糖 氨基酸 促生长因子 无机盐 微量元素 维生素 动物血清 血浆等 36 5 0 5度 7 2 7 4 O2 细胞代谢所必须CO2 主要维持培养液的PH 95 空气和5 CO2 5 动物细胞培养的条件 合成培养基 合成培养基成分已知 便于对实验条件的控制 但与天然培养基相比 有些天然的未知成分尚无法用已知的化学成分所替代 因此 细胞培养中使用的基础合成培养基还必须加入一定量的天然培养基成分 以克服合成培养基的不足 最普遍的作法是加入小牛血清 天然培养基 直接采用取自动物体液或从组织中提取的成分作培养液 主要有血清 组织提取液 鸡胚汁等 使用最普遍的天然培养基是血清 基本以小牛血清最普遍 血清由于含有多种细胞生长因子 促贴附因子及其多活性物质 与合成培养基合用 能使细胞顺利增殖生长 无血清培养基 动物血清成分复杂 各种生物大小分子混合在一起 有些成分至今尚未搞清楚 血清对细胞生长很有效 但后期对培养产物的分离 提纯以及检测造会成一定困难 另外高质量的动物血清来源有限 成本高 限制了它的大量使用 无血清培养基不加动物血清 在基础培养基中加入细胞生长有效因子 激素等 P46为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清 血清中含有蛋白质 氨基酸 葡萄糖 激素等 其中蛋白质主要为白蛋白和球蛋白 氨基酸有多种 是细胞合成蛋白质的基本成分 其中有些氨基酸动物细胞本身不能合成 称为必需氨基酸 必须由培养液提供 血清激素有胰岛素 生长激素等及多种生长因子 血清还含有多种未知的促细胞生长因子 促贴附因子及其他活性物质 能促进细胞的生长 增殖和贴附 因此 细胞培养时 要保证细胞能够顺利生长和增殖 一般需添加10 20 的血清 超净工作台 CO2培养箱 冰箱 6 动物细胞培养技术的应用 生产蛋白生物制品 病毒疫苗 干扰素 单克隆抗体等健康细胞培养 如获得大量自身的皮肤细胞 用于植皮 用于检测有毒物质用于生理 病理 药理等方面的研究 为治疗和预防疾病提供理论依据 植物组织培养和动物细胞培养的比较 细胞的全能性 细胞增殖 固体培养基 液体培养基 蔗糖植物激素 葡萄糖动物血清 植物体 细胞株 细胞系 快速繁殖 培育无病毒植株 获得细胞或细胞分泌蛋白 1 动物细胞全能性的表现程度不同 受精卵 胚胎干细胞 多能干细胞 单能干细胞 体细胞 是将动物的一个细胞的细胞核 移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中 使其重组并发育成一个新的胚胎 这个新的胚胎最终发育为动物个体 用核移植的方法得到的动物称为克隆动物 3 分类 细胞分化程度低 恢复全能性容易 细胞分化程度高 恢复全能性困难 2 动物核移植 4 过程 将动物的一个细胞的细胞核 移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中 使其重组并发育成一个新的胚胎 这个新的胚胎最终发育成动物个体 用核移植的方法得到的动物称为克隆动物 核移植 难度高 受体细胞 M 期的卵母细胞 细胞分化程度低 恢复全能性容易 二 动物体细胞核移植技术和克隆动物 1 概念 2 分类 动物细胞的全能性特点 动物细胞特点 分化潜能变窄 随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制 分化潜能变窄 这是指整体细胞而言 细胞核仍具有全能性 细胞核 它含有保持物种遗传性所需的全套基因 而且并没有因细胞分化而丢失基因 因此高度分化细胞的细胞核仍具有全能性 复习 1 我们能否用植物组织培养的方法使动物细发育成动物个体 2 根据动物细胞核仍具有全能性的特点 怎样将动物细胞的全能表达 把两种动物的优良性状集合在一块儿 思考 不能 利用 动物体细胞核移植技术动物细胞融合 3 过程 供体细胞 供核 细胞培养 体细胞 卵母细胞 M 中期 供质 去核 无核卵母细胞 注入 细胞融合 杂种细胞 构建重组胚胎 胚胎移植 代孕母体 新个体 与母体基本相同的个体 杂种细胞 核移植 胚胎移植 动物体细胞核移植过程 P49 讨论2 1 在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前 为什么必须先去掉受体卵母细胞的核 为使核移植动物的主要遗传物质全部来自有利用价值的动物提供的细胞 2 用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞 想一想 这是为什么 10代以内的细胞一般保持正常二倍体的核型 未发生突变 3 你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物 是对体细胞供体动物进行了100 的复制吗 为什么 克隆动物绝大部分DNA来自于供体细胞核 但其核外还有少量的DNA 即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞 此外 即便动物的遗传基础完全相同 还与所处环境有很大关系 细胞质 细胞核 细胞核移植 4 多莉羊的培育过程 克隆羊的成功证明了什么 1 动物体细胞核具有全能性 2 细胞质具有调控细胞核发育的作用 1 对比多莉羊和高产奶牛的克隆过程 找出操作过程的不同点 多莉克隆过程的受体细胞是去核卵细胞 而高产奶牛的克隆过程的受体细胞是去核卵母细胞 多莉克隆过程是将供体细胞核注入受体细胞 而高产奶牛的克隆过程是将供体细胞注入受体细胞 思考题 2 讨论分析上述哪一种措施更科学 并说明理由 卵母细胞当中的细胞周期蛋白含量 活性比卵细胞高 用它作受体更容易成功 将供体细胞注入受体细胞 使克隆动物更像供体动物 操作也方便 高产奶牛的克隆过程更科学 5 体细胞核移植技术的应用前景 1 在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程 2 保护濒危物种 3 利用转基因克隆动物生产医用蛋白质 4 用于器官移植的的供体 5 使人类深入了解胚胎发育及衰老过程 6 追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病 6 体细胞核移植技术存在的问题 1 成功率低2 存在健康问题 如异常肥胖 发育困难 脏器缺陷 免疫失调等 3 克隆动物食品的安全性也存在争议4 克隆动物的各个环节也有待改进 据统计 按照出生健康后代和总操作卵之间的比值计算 各种动物的克隆总效率分别为牛0 5 绵羊0 4 4 3 山羊0 7 7 2 小鼠0 2 5 8 猫0 3 兔0 3 大鼠0 2 猪0 1 0 9 骡子0 9 马0 2 经过10年的发展 体细胞核移植效率有所提高 尤其是牛 但其最高效率也仅为10 资料一 日本东京国立传染病研究所实验动物开发室小仓淳室长在著名生物科学杂志 NatureGenetics 上发表了对克隆动物的研究结果 克隆小鼠的寿命要比自然交配出生的小鼠寿命明显缩短 小仓室长对死亡的克隆小鼠进行病理检查发现 死亡小鼠均患有肺炎 一部分小鼠合并有肝脏异常病状 小仓室长以同种方法另外制作了20只克隆小鼠 并委托日本东北大学农学部的西田朗教授对其进行免疫系统机能的检查 结果发现 这些克隆小鼠的抗体生成能力比自然交配出生的小鼠明显降低 资料二 可以利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛 3 1 能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗 请说明理由 思考题 首先从卢辛达耳朵上剪取一小块组织 在体外培养获得该组织的细胞 从屠宰场取废弃的牛卵巢 抽取卵母细胞体外培养成熟 用显微针去除卵母细胞的核 再将耳细胞注入卵母细胞 用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合 这时供体核就进入了受体卵母细胞 再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞 使其完成细胞分裂和发育过程 核移植胚胎在体外短时间培养后 挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内 2 如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你 你将如何对它进行克隆 在研究方面 克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚 克隆技术效率低 克隆动物畸形率高 死亡率高 易出现早衰等问题 这些问题尚在研究中 在应用上 生产克隆动物费用昂贵 距大规模应用还有一定距离 4 体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么问题 请你查阅资料 了解这方面的前沿动态 D 例题解析 1 动物细胞工程技术的基础是 A 动物细胞融合B 单克隆抗体C 胚胎移植D 动物细胞培养 解析 动物细胞工程中技术包括动物细胞培养 动物细胞融合 胚胎移植和单克隆抗体 其中动物细胞培养是其他技术的基础 2 在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是A 细胞系B 细胞株C 原代细胞D 传代细胞 A 解析 细胞株传代至50代后出现细胞生长停滞状态 只有部分细胞由于遗传物质的改变 使其在培养条件下可以无限制传代 这种传代细胞为细胞系 3 用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织 其主要原因是这样的组织细胞 A 容易产生各种变异B 具有更强的全能性C 取材十分方便D 分裂增殖的能力强 D 4 动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于A 培养基不同 B 动物细胞培养不需要在无菌条件下进行 C 动物细胞可以传代培养 而植物细胞不能 D 动物细胞能够大量培养 而植物细胞只能培养成植株 A 5 在动物细胞培养的有关叙述中正确的是A 细胞的癌变发生于原代培养向传代培养的过渡过程中B 动物细胞培养液中通常含有葡萄糖 氨基酸 无机盐 生长素和动物血清等C 动物细胞培养的目的是获得大量的细胞D 动物细胞培养前和培养过程中都要用胰蛋白酶处理 D 6 利用下列细胞工程技术培育出的新个体中 只具有一个亲本遗传性状的是 细胞和组织培养 细胞融合 动物胚胎移植 克隆技术A B C D C 1 用动 植物成体的体细胞进行离体培养 下列叙述正确的是A 都需用培养箱B 都须用液体培养基C 都要在无菌条件下进行D 都可体现细胞的全能性 链接高考 C 解析 动 植物成体的体细胞进行离体培养都要在无菌条件下进行 动物成体的体细胞离体培养用液体培养基 不能体现细胞的全能性 植物成体的体细胞离体培养不一定用液体培养基 能体现细胞的全能性 故C正确 2 下列不属于动物细胞工程应用的是A 大规模生产干扰素 用于抵抗病毒引起的感染B 为大面积烧伤的病人提供移植的皮肤细胞C 大规模生产食品添加剂 香料等D 利用胚胎移植技术 加快优良种畜的繁殖 C 解析 大规模生产食品添加剂 香料等是植物细胞工程的应用 动物细胞工程无此应用 3 试管婴儿 技术属于A 胚胎移植B 组织培养C 克隆技术D 基因工程 A 解析 试管婴儿是获得精子和卵细胞后 在体外受精 之后把早期的胚胎移植到体内 属于胚胎移植技术 繁殖方式为有性生殖 而克隆是无性繁殖的意思 比如体细胞核移植技术得到的动物为克隆动物 4 胚胎移植技术目前主要应用于A解决某些不孕症者的生育问题B治疗某些遗传病C提高良种家畜的繁殖力D提高动物的抗病力 AC 5 回答下列有关动物细胞培养的问题 在动物细胞培养过程中 当贴壁细胞分裂生长到细胞表面时 细胞会停止分裂增殖 这种现象称为细胞的 此时 瓶壁上形成的细胞层数是 要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来 需要用酶处理 可用的酶是 随着细胞传代次数的增多 绝大部分细胞分裂停止 进而出现现象 但极少数细胞可以连续增殖 其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成细胞 该种细胞的黏着性 细胞膜表面蛋白质 糖蛋白 的量 相互接触 接触抑制 一层 胰蛋白酶 衰老甚至死亡 不死性 降低 减少 3 检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目 最好选用细胞分裂到期的细胞用显微镜进行观察 4 在细胞培养过程中 通常在条件下保存细胞 因为在这种条件下 细胞中的活性降低 细胞的速率降低 5 给患者移植经细胞培养形成的皮肤组织后 发生了排斥现象 这是因为机体把移植的皮肤组织当作进行攻击 中 低温 酶 新陈代谢 抗原 苏丹红是一种人工色素 工业染料 它在人体内代谢生成相应的胺类 科研人员以小鼠为实验材料 用 动物细胞培养技术 对苏丹红毒性进行了检测 1 该方法检测有毒物质毒性的指标是 2 请完善检测苏丹红毒性的实验 主要实验步骤 第一步 取大小相同的六只培养瓶依次编号为l 6 分别加入等量相同的培养液和小鼠细胞 第二步 第三步 结果如下表 结论 变异细胞占全部培养细胞的比例 向1号瓶中加入适量的水 向2 6号瓶中加入等量不同浓度的苏丹红添加剂 培养一段时间后 取样制成临时装片 观察记录变异细胞的数目 低浓度的苏丹红毒性很小 随浓度增加毒性逐渐增强 动物细胞培养技术的应用 动物细胞培养技术的应用 继哺乳动物乳腺发生器研发成功后 膀胱生物发生器的研究也取得了一定进展 最近 科学家培养出一种转基因小鼠 其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中 请回答 1 将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞 常用方法是 2 在研制膀胱生物反应器时 应使外源基因在小鼠的细胞中特异表达 5 为使外源基因在后代长期保持 可将转基因小鼠细胞的转入细胞中构成重组细胞 使其发育成与供体具有相同性状的个体 该技术称为 该重组细胞发育的过程中还应用了技术 显微注射法 膀胱上皮 细胞核 去核的卵母细胞 细胞核移植 动物细胞培养