质粒的提取和纯化.ppt

质粒的提取和纯化 内容 一 质粒的概念和提取原理二 碱裂解法的实验操作和原理三 煮沸法快速提取质粒的实验操作和原理四 实验室使用的方法五 质粒纯化后的检测 一 质粒的概念和提取原理 质粒 Plasmid 是一种染色体外的稳定遗传因子 大小从1 200kb不等 为双链 闭环的DNA分子 并以超螺旋状态存在于宿主细胞中 质粒主要发现于细菌 放线菌和真菌细胞中 它具有自主复制和转录能力 能在子代细胞中保持恒定的拷贝数 并表达所携带的遗传信息 质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质 如离开宿主细胞则不能存活 而宿主即使没有它们也可以正常存活 一 质粒的概念和提取原理 质粒在细胞内的复制一般有两种类型 紧密控制型 Stringentcontrol 松驰控制型 Relaxedcontrol 一 质粒的概念和提取原理 在pH12 0 12 6碱性环境中 细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开 而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态 将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下 大部分染色体DNA 大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀 而质粒DNA仍然为可溶状态 通过离心 可除去大部分细胞碎片 染色体DNA RNA及蛋白质 质粒DNA尚在上清中 然后用酚 氯仿抽提进一步纯化质粒DNA 实验中使用的三个溶液 1 溶液 葡萄糖 使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部 Tris Cl pH8 0 提供反应的最佳环境 EDTA pH8 0 Ca2 和Mg2 等二价金属离子的螯合剂 抑制DNase 脱氧核糖核酸酶 的活性和抑制微生物生长 实验中使用的三个溶液 2 溶液 NaOH 临用前用10mol LNaOH母液稀释 1 SDS注 要新从浓NaOH稀释制备NaOH 是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性 NaOH细胞膜发生了从bilayer 双层膜 结构向micelle 微囊 结构的相变化 瞬间就溶解 当然SDS也是碱性的 但是很弱 只能抽提得到少量质粒 实验中使用的三个溶液 3 溶液 KAc冰醋酸ddH2O注 冰醋酸的作用是为了中和过量的NaOH KAc是提供K 和SDS反应 取代Na离子 形成十二烷基硫酸钾 PDS 而PDS是难溶于水的 SDS易和蛋白质结合 平均两个氨基酸上结合一个SDS分子 钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了 同时长长的基因组DNA也一起被共沉淀了 但是SDS并不与DNA分子结合 二 碱裂解法的操作步骤 1 取培养至对数生长后期的含质粒的细菌培养液 高速离心 弃上清 将离心管倒置使上清液全部流尽 2 加入溶液I 充分悬浮菌体细胞 3 加入新配制的溶液II 盖紧瓶盖 缓缓地颠倒离心管数次 以充分混匀内容物 冰浴5分钟 4 加用冰预冷的溶液III 摇动离心管数次以混匀内容物 冰上放置15分钟 此时应形成白色絮状沉淀 5 4 下离心15分钟 二 碱裂解法的操作步骤 6 取上清液 加入RNA酶A 37 水浴20分钟 7 加入等体积的饱和酚 氯仿 振荡混匀 4 下高速离心10分钟 8 取上层水相 加入等体积氯仿 振荡混匀 4 下高速离心10分钟 9 取上层水相 加入2倍体积的无水乙醇 室温放置几分钟 离心 10 4 下高速离心15分钟 沉淀用数ml70 冰冷乙醇洗涤 4 下高速离心5分钟 11 吸除上清液 将管倒置于卫生纸上使液体流尽 真空干燥10分钟或室温干燥 12 得到的质粒样品一般用TE缓冲液或者ddH2O进行溶解 注意的事项 一 在加溶液 后 时间不能过长 因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂 必须温柔混合 不然基因组DNA也会断裂 二 加入的酚必须要用氯仿和乙醇洗涤干净 否则对后面的实验有影响 三 沉淀DNA也可用异丙醇 一般使用等体积 且沉淀完全 速度快 但常把盐沉淀下来 所以多数还是用乙醇 四 提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要 采用酚 氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好 要将蛋白尽量除干净需多次抽提 三 煮沸法快速提取质粒的操作步骤 1 将2ml含相应抗生素的LB培养基加入到容量为15ml的试管中 接种一单菌落 用棉塞封口 在37 剧烈震荡 250rpm 培养过夜 2 将1 5ml培养物转入离心管中 在4 条件下离心30秒 3 弃上清液 用滤纸吸干离心管中的液体培养基 将细菌沉淀物悬浮于200mlSTET缓冲液 8 蔗糖 0 5 Triton 50mmol LEDTA 10mmol LTris 用涡旋混合器充分混匀 4 加入4ml新鲜配制的溶菌酶液 混匀 置室温下5min 5 用漂子架住离心管 置于沸水浴中 精确记时45秒 取出后立刻离心10min 三 煮沸法快速提取质粒的操作步骤 6 用无菌牙签挑取离心管中的沉淀物弃去 离心管的上清液中加入8ml5 CTAB 十六烷基三甲基溴化氨 用混合器混匀后 高速离心5min 弃上清液 用滤纸吸干离心管中的液体 7 加入1 2M氯化钠300ml 充分溶解沉淀物 再加入750ml的冷乙醇 充分混匀后 离心15min 弃上清液 8 取1ml70 冷乙醇 缓慢淋洗离心管内壁 离心5min 弃上清液 用滤纸吸干管壁上的液体 置室温中使核酸沉淀自然干燥5 10min 9 沉淀物溶于50mlTE缓冲液中 混合器混匀 10 即成质粒制备液 制备的质粒供下一步实验使用 四 实验室使用的操作步骤 1 取1 5ml含细菌的培养液 离心 弃上清 将离心管倒置使上清液全部流尽 2 加入溶液I 充分悬浮菌体细胞 3 加入新配制的溶液II 盖紧瓶盖 缓缓地颠倒离心管数次 以充分混匀内容物 冰浴5分钟 4 加用冰预冷的溶液III 摇动离心管数次以混匀内容物 冰上放置15分钟 此时应形成白色絮状沉淀 5 4 下离心15分钟 四 实验室使用的操作步骤 6 取上清液加新的离心管中 7 加入纯化树脂 混匀 放置10min 8 将溶液转移到离心纯化柱中 高速离心 9 倒掉下管中的溶液 再加80 异丙醇 洗涤两次 每次离心30s 再干甩一次 20min 10 将离心纯化柱内管取出 放入新的离心管中 加入30 l的ddH2O洗涤 静置10min 高速离心5min 11 离心管中即得到溶于ddH2O的质粒 五 质粒纯化后的检测 超螺旋开环复制中间体 可能会出现的RNA带 注 碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA