蔗糖酶米氏常数的测定.ppt

目的 了解底物浓度与酶反应速度间的关系 学习求蔗糖酶米氏常数的方法 原理 米氏方程式v 米氏常数的求法很多 最常用的是Lineweaver Burk的作图法 双倒数作图法 米氏方程式可改写为下列倒数形式 选择不同的 s 测定相应的v 求出两者的倒数 以1 s 为横坐标 以1 v为纵坐标作图 绘出一条直线 外推至横轴相交 横轴截距即为 1 Km 蔗糖酶米氏常数的测定 还原糖与3 5 二硝基水杨酸 DNS 试剂反应 仪器与试剂 1 仪器 分光光度计 恒温水浴 试管 吸管 秒表 坐标纸2 试剂标准葡萄糖溶液 1mg mL 3 蔗糖溶液 87 7mM 0 2mol LNaAc缓冲溶液 pH4 6 0 5mol LNaOH溶液3 5 二硝基水杨酸试剂 操作步骤 1 葡萄糖标准曲线的制定 将各管溶液混合均匀 在沸水浴中加热5min 取出后立即用冷水冷却至室温 以蒸馏水稀释至25mL 摇匀 测540nm处A值 以葡萄糖含量 mg 为横坐标 A值为纵坐标作出标准曲线 取试管8支编号 按下表将蔗糖溶液 醋酸缓冲液分别加入试管 于37 水浴中保温10min 一定量酶液同一水浴中保温约10min 于各管中依次按同样间隔 0 5min 加入已保温过的酶液1 0mL 计时 立即摇匀 在37 中准确温浴5min 按同样次序和时间间隔 加入1mL0 5mol LNaOH 摇匀 终止反应 吸取反应物1 0mL 加入盛有3 0mL3 5 二硝基水杨酸试剂和1 0mL水的试管中混匀 放入沸水浴中加热5min 冷却后稀释至25mL 摇匀 在540nm比色测定A值 以A值对应的葡萄糖量为相对反应速度 以1 S 为横坐标 1 v为纵坐标作图 由图求出Km值 2 底物浓度和初速度 测定