肿瘤药理学实验方法ppt课件

药理学实验方法 肿瘤药理学实验方法 1 肿瘤 tumor 是机体在各种致病因素的作用下 局部组织的细胞异常增生而形成的新生物 neoplasm 常表现为局部肿块 白血病非局部肿块 2 细胞毒类药物 生物反应调节剂 分化诱导剂 化学预防药 逆转肿瘤耐药性药物 抗肿瘤侵袭 转移的药物 放疗及化疗增敏剂 抗肿瘤药物 3 细胞毒类药物 体外实验方法 动物肿瘤体内筛选法 抗癌药作用机理研究方法 生物反应调节剂 体内抗癌试验的方法 免疫功能的研究方法 分化诱导剂 细胞形态学及组织化学研究方法 细胞功能的研究方法 与分化有关的基因及其表达的研究方法 化学预防药 体外诱导细胞转化的方法 体内诱癌试验 化学预防剂作用机理的研究 逆转肿瘤耐药性药物 肿瘤细胞耐药表型和机制 肿瘤耐药细胞株的建立及鉴定 寻找肿瘤耐药性逆转剂的方法 抗肿瘤侵袭 转移的药物 肿瘤侵袭 转移与实验方法概述 肿瘤侵袭 转移的实验动物模型 肿瘤侵袭的体外模型及相关生物学特性研究新血管生成的研究方法 放疗及化疗增敏剂 放疗增敏剂的正名 定义及其研究特点 离体细胞培养实验技术 整体动物实验技术 各类抗肿瘤药物所涉及到的药理学实验方法 4 细胞毒类药物 体外实验方法 动物肿瘤体内筛选法 抗癌药作用机理研究方法 生物反应调节剂 体内抗癌试验的方法 免疫功能的研究方法 分化诱导剂 细胞形态学及组织化学研究方法 细胞功能的研究方法 与分化有关的基因及其表达的研究方法 化学预防药 体外诱导细胞转化的方法 体内诱癌试验 化学预防剂作用机理的研究 附 胃癌变动物模型 逆转肿瘤耐药性药物 肿瘤细胞耐药表型和机制 肿瘤耐药细胞株的建立及鉴定 寻找肿瘤耐药性逆转剂的方法 抗肿瘤侵袭 转移的药物 肿瘤侵袭 转移与实验方法概述肿瘤侵袭 转移的实验动物模型肿瘤侵袭的体外模型及相关生物学特性研究心血管生成的研究方法附 LA 795自发肺癌实验转移模型 放疗及化疗增敏剂 放疗增敏剂的正名 定义及其研究特点离体细胞培养实验技术 整体动物实验技术 各类抗肿瘤药物所涉及到的药理学实验方法 5 肿瘤细胞体外实验方法 动物的 人的 动物肿瘤体内实验方法 移植性 诱发性 也可在体外诱发 自发性 肿瘤转移的动物实验模型 肿瘤免疫药理研究方法 体外 体内 肿瘤药理学基本的实验方法 6 一 肿瘤细胞培养的基本条件二 肿瘤细胞的培养与传代三 肿瘤细胞的活性检测 形态观察 细胞排染试验 细胞生长曲线 抗癌作用测定 克隆形成试验 半数抑制浓度的计算 肿瘤细胞体外实验方法 InVitro 7 无菌室 超净工作台 消毒器 CO2孵箱 倒置显微镜 酶标仪 培养板 培养瓶 营养液 等等 肿瘤细胞体外实验所需要的基本条件 8 原代细胞培养与传代细胞培养贴壁细胞传代与悬浮细胞传代 肿瘤细胞的培养与传代 9 肿瘤细胞培养原代细胞培养 原代培养 PrimaryCulture 也称初代培养 即从体内取出组织 接种细胞培养到第一次传代之前 一般可持续1 4周 此期细胞可见到细胞分裂 但不旺盛 原代培养细胞细胞克隆形成率 CloningEfficiency 很低 克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时 形成细胞小群 克隆 的百分数 初代培养细胞也可用于检测药物的生物活性 10 传代培养 Passageculture 将培养的细胞分散 从容器中取出 以1 2或l 3以上的比例转移到另外的容器中进行培养 即为传代培养 为什么要进行传代 体外培养的肿瘤细胞密度过大 生存空间不足 可引起营养枯竭从而停止生长 因此 要在体外持续地培养就必须传代 以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞用于研究 并维持细胞种的延续 肿瘤细胞培养传代细胞培养 11 细胞 一代 指从细胞接种在培养器皿到分离再培养的一段期间 细胞倍增时间 指此次细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所需的时间 一代 与 倍增 的概念不同 在一代中 细胞可培增2 3次甚至5 6次 肿瘤细胞培养传代代数与细胞倍增时间 12 细胞传代后 一般经过游离期 指数增生期 坪台期三个阶段游离期 细胞接种后从悬浮状态到细胞贴瓶 指数增生期 细胞接种2 3天分裂增殖比较旺盛 是活力最好时期 称指数增生期 对数生长期 适宜进行各种试验 坪台期 停止期 细胞密度已饱和 细胞停止增殖 但代谢活动仍在进行 肿瘤细胞体外培养指数增生期 13 肿瘤细胞培养可分为单层贴壁培养和悬浮培养 悬浮培养是指细胞悬浮于培养基中进行生长或维持 单层贴壁培养是指细胞贴附在培养器皿表面生长的方法 将细胞消化后分散成单个细胞后种入器皿 细胞置含37 5 CO2的孵箱中培养 一般经过3 6h 细胞沉于器皿底部 附着于玻璃或塑料层的培养面 分裂 向四周生长 逐渐融合形成细胞单层 正常二倍体细胞在两个细胞集落生长到相互接触时 由于细胞信息的传递 生长即停止 即生长接触抑制 恶性转化细胞或恶性肿瘤细胞由于具有失去接触抑制的特性 在生长到细胞相互接触时 还能继续生长 形成重叠层 细胞生长到旺盛期 即可进行传代 肿瘤细胞培养悬浮培养与贴壁培养 14 肿瘤细胞传代悬浮细胞的传代 悬浮细胞是指细胞呈单个或细胞团悬浮在培养液中生长 当细胞生长到一定密度时 进入坪台期 即需传代 传代方法 取少量细胞悬液移入新培养器皿 加入新鲜培养液即可 15 1 打开瓶口 过火后 轻轻倒去培养液 2 用PBS或用Hank s液2ml洗1 2次 加入0 05 0 25 胰蛋白酶适量 消化1 3min 3 在显微镜下观察细胞呈圆球状时 或肉眼观察培养瓶细胞面出现布纹孔状 表示细胞已从壁上消化下来 倒去胰蛋白酶 可用Hank s液轻轻洗1 2次 4 加入新鲜培养液后 用滴管轻轻吹打 使细胞从培养皿或培养瓶表面脱落 混合成细胞悬液 以适量接种入新培养器皿中 肿瘤细胞传代贴壁细胞的传代 16 1 培养液中可加入适量青霉素 链霉素 2 用于调pH值的7 NaHCO3用0 1 0 22 m滤膜过滤灭菌 勿高压灭菌 3 洗去胰蛋白酶时应该用D Hanks液 而不是Hanks液 4 传代时细胞分散密度要适当 不能太低 因肿瘤细胞的自泌促生长因子会因分散培养而被稀释 达不到肿瘤生长的需求 降低肿瘤细胞的生长增殖力 肿瘤细胞培养与传代注意事项 17 分离纯化外科肿瘤组织中肿瘤细胞的方法1 取材 材料主要来源于外科手术或活检肿瘤组织 取材时避免用坏死组织 要挑选瘤细胞集中和活力较好的部位 瘤性转移淋巴结或胸腹水是较好的培养材料 取材后尽快培养 因故不能立即培养者 可冻存 2 成纤维细胞排除 在肿瘤组织中常混杂有一些成纤维细胞 培养时能与瘤细胞同时生长 并常压过癌细胞 导致癌细胞生长受阻 应仔细排除 排除方法常有 机械刮除法 反复贴壁法 消化排除法 胶原酶消化法等 18 成纤维细胞排除机械刮除法 机械刮除法是用不锈钢钢丝末端插有橡胶刮头 用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝 或裹少许脱脂棉制成 装入试管中高压灭菌后备用 刮除程序为 1 标记 镜下观察 用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位 2 刮除 弃掉培养液 把无菌胶刮伸入瓶皿中 肉眼或显微镜窥视下 刮除无标记空间 3 用Hanks液冲洗一两次 洗除被刮掉的细胞 4 注入培养液继续培养 如发现仍有成纤维细胞残留 可重复刮除至完全除掉为止 19 根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点 并结合使用不加血清的营养液 把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁 使两类细胞相互分离 操作方法与传代相同 1 待细胞生长达一定数量后 倒出旧培养液 用胰酶消化后 Hanks冲洗2次 加入不含血清的培养液 吹打制成细胞悬液 2 取编号为此A B C三个培养瓶 首先把悬液接种入A培养瓶中 置温箱中静止培养5 20分钟后 轻轻倾斜培养瓶 让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液 再接种入B培养瓶中后 向A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养 3 培养B瓶中细胞5 20分钟后 按处理A的方法 把培养液注入C培养瓶中 再向B瓶中补加完全培养基 当三个瓶内都含有培养液后 均在温箱中继续培养 如操作成功 次日观察可见A瓶主要为成纤维细胞 B瓶两类细胞相杂 C瓶可能主要为癌细胞 必要时可反复处理多次 直至癌细胞纯化为止 成纤维细胞排除反复贴壁法 20 消化排除法 根据成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落的特点 此法曾用于乳癌细胞的培养 具体程序是 1 先用0 5 胰蛋白酶和0 02 EDTA 1 1 混合液漂洗培养细胞一次 然后再换成新的混合液继续消化 并在倒置显微镜下观察和不时摇动培养瓶 到半数细胞脱落下来后 便立即停止消化 2 把消化液吸入离心管中 离心去上清 吸入另瓶中 加培养液置温箱中培养 向原瓶内也补加新的培养液继续培养 经过几次反复处理 可能把成纤维细胞除净 21 胶原酶消化法 利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点 通过消化进行选择 1 可用0 5mg ml的胶原酶消化处理 边消化边在倒置显微镜下观察 当发现成纤维细胞被除掉后 即终止消化 2 用Hanks洗涤处理一次后 更换新培养液 继续培养 可获纯净肿瘤细胞 如成纤维细胞未被除净 可再次重复 22 其它方法 有人发现聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用 也有人用聚蔗糖制备成比重1 025 1 085的密度梯度离心液 加入细胞悬液后 在23 中800g离心10分种 在比重1 025 1 050层为成纤维细胞 在比重1 050 1 085层为上皮细胞 再经过分离进行培养 最近也有人应用特殊化学物如SOD抑制成纤维细胞生长的方法 选用上述任何一种方法 都需进行试验 取得必要经验 找出适合的条件 才能获得好的效果 23 肿瘤细胞培养的基本条件 肿瘤细胞的培养与传代 肿瘤细胞的活性检测 形态观察 细胞排染试验 细胞生长曲线 MTT试验 克隆形成试验 半数抑制浓度的计算 肿瘤细胞体外实验 24 肿瘤细胞的活性检测 形态观察 细胞排染试验 细胞生长曲线 MTT试验 克隆形成试验 半数抑制浓度的计算 25 肿瘤细胞的活性检测 形态观察 主要观察细胞的一般形态 如大体形态 核浆比例 染色质和核仁大小 多少等以及细胞骨架微丝微管的排列状态等 26 实验原理细胞损伤或死亡后细胞膜完整性破坏 正常的活细胞拒染 而死亡的细胞则染成蓝色 实验方法取100 l细胞悬液加等量0 4 台盼蓝染色液 搅动细胞使之与染料混合均匀 滴入血球计数板 稳定2min后进行观察 在l5min内用血细胞计数板计数200个细胞 未染色的是活细胞 死细胞呈蓝色 分别计数染色细胞与不染色细胞 求得细胞存活率 肿瘤细胞的活性检测 细胞排染试验 27 细胞排染试验 细胞存活率 100 未经任何处理的培养细胞 细胞存活率应达95 以上 28 细胞生长抑制率 观察药物的作用 可对实验组与对照组分别计数活细胞数 即末染色细胞数 再根据下列公式求得细胞生长抑制率 100 29 细胞悬液与台盼蓝染色液混匀后 应在5min内计数完毕 时间过长 由于细胞活度下降而通透性增加 从而影响拒染细胞数 因而影响实验的真实结果 细胞排染试验注意事项 30 在最适条件下 肿瘤细胞在培养液中随着培养时间延长呈指数生长 以培养时间为横坐标 细胞数的对数为纵坐标作图 可得一条直线 故称此时为对数生长期 随着细胞密度不断增高 由于代谢产物的积聚及营养物的消耗 细胞生长逐渐减慢以致停止 此时称高坪期或稳定期 药物对细胞生长的影响可通过生长曲线反映出来 实验原理 肿瘤细胞的活性检测 肿瘤细胞生长曲线 31 选取对数生长期的肿瘤细胞 用含10 小牛血清的RPMI1640培养基配成细胞浓度为1 104 ml的细胞悬液分装在培养瓶中 实验组加入不同浓度的被测样品 对照组加入等体积的溶剂 细胞置含37 5 CO2的孵箱中培养 在培养后ld 2d 3d 4d 5d 7d各取样 置血细胞计数板中计数 以每毫升细胞数的对数为纵坐标 以时间为横坐标绘制生长曲线 计数法 注意 悬浮细胞同一培养物可连续取样 而贴壁细胞每个培养瓶只能作一次计数 故要计算好需要的细胞瓶数 实验方法 肿瘤细胞的活性检测 肿瘤细胞生长曲线 32 药物对细胞的杀伤率 100 也可用MTT法测定细胞生长曲线 N0 对照组生长曲线线性部分外推至y轴的截距 代表接种后对照组具有增殖力的细胞数 N0 实验组生长曲线线性部分外推至y轴的截距 代表接种后实验组具有增殖力的细胞数 33 MTT比色法 活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT 噻唑蓝 Thiazolylblue 还原为蓝紫色结晶 并沉淀在细胞里 而死细胞中琥珀酸脱氢酶消失 不能将MTT还原 DMSO能够溶解细胞中的蓝紫色结晶甲臜 formazan 用酶标仪在570nm波长处测定其吸光度值 OD值 OD值的大小可间接反映活细胞的数量 在一定细胞数范围内 MTT结晶物的形成量与活细胞数成正比 由吸光度值 根据相关公式计算抑制率 MTT实验 实验原理 34 实验方法1 将对数生长期的肿瘤细胞用胰蛋白酶消化后 用含10 小牛血清的培养基配成浓度约为5000个细胞 ml的细胞悬液 2 接种在96孔培养板中 每孔接种200 l 3 经37 5 CO2的温箱中培养24h 4 实验组加入含不同浓度药物的培养液 对照组则用等体积的培养液 每组设3个以上的平行孔 37 5 CO2 培养所设定的时间 MTT实验 35 实验方法5 弃去上清液 用培养液洗3次 以去除药液 然后 每孔加入200 l含0 2mg mlMTT的无血清培养基 在37 培养4h 6 小心弃去上清 并加入200 l酸化异丙醇 或DMSO 溶解MTT甲臜沉淀 用振荡器混匀后 在酶标仪上用波长为570nm 参比波为450nm测定光密度 OD 值 MTT实验 36 按公式计算IC50举例 各组药物浓度 0 1 0 01 0 001 0 0001 0 00001 0 000001 稀释倍数为10 最大浓度为0 1 抑制率分别为 0 95 0 80 0 65 0 43 0 21 0 06 将上述数据代入下列计算公式 lgIC50 Xm I P 3 Pm Pn 4 Xm 最大剂量的对数 lg0 1 1I 最大剂量 相邻剂量 的对数 lg0 1 0 01 lg10 1P 阳性反应率之和 0 95 0 80 0 65 0 43 0 21 0 06 3 1Pm 最大阳性反应率 0 95 Pn 最小阳性反应率 0 06lgIC50 1 1 3 1 3 0 95 0 06 4 3 6025IC50 0 00025 37 肿瘤细胞体外实验是进行抗癌药物筛选检测 研究癌变机理以及恶性肿瘤分子生物学研究的重要手段 主要优点如下 1 不需要用动物 能很方便 很经济的进行很多种药物的筛选 2 可比较准确的控制药物作用的时间 剂量和条件 并可准确的选择药物作用的靶位 3 将药物直接加入到肿瘤细胞培养体系中 使药物直接与细胞接触 可提示药物的直接作用或体内的间接作用 肿瘤细胞体外实验方法主要优点 38 1 与体外实验相比 体内的生长环境极为复杂 因此体外的药效作用在体内并不一定都能相对应 2 对复方药和中药研究较为困难 尤其是药物的颜色 可因为影响比色结果而影响对药物的评价 3 水溶性的药物较易研究 而非水溶性的药物则较难 可进行血清药理学研究 因此 要将体外的实验结果与体内的结合起来才能较为全面而科学地评价药效 肿瘤细胞体外实验方法主要缺点 39 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞 即称之为细胞系 CellLine 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法 由单细胞增殖形成的细胞群 称细胞株 Cellstrain 细胞株与细胞系的概念 40 肿瘤细胞体外实验方法 动物的 人的 动物肿瘤体内实验方法 移植性 诱发性 自发性 肿瘤转移的动物实验模型 肿瘤免疫药理研究方法 肿瘤药理学基本的实验方法 41 体内实验Invivo 肿瘤药理学实验方法 InVitro 42 肿瘤药理学体内实验方法 整体动物实验法是评价一个药物是否有效的最主要的方法 即使在体外有一个很好的疗效 最终也一定要在体内进行观察 因此 用整体动物实验方法来观察药物的作用显得很重要 研究药物的体内抗肿瘤作用 就必须建立各种肿瘤的动物模型 模型越接近于人体其意义越大 43 动物肿瘤体内实验方法 实验动物的选择 移植性动物肿瘤模型 诱发性动物肿瘤模型 自发性动物肿瘤模型 44 不同种类的动物对致癌物质的敏感性不同 其癌自发率也不同 常用于自发 诱发或移植的动物有 小鼠 裸鼠 金黄地鼠 大鼠豚鼠 两栖类动物如蛙 鸟类 其它许多家畜如猪马牛羊犬猫家兔等都可发生各种肿瘤 动物肿瘤体内实验方法动物的选择 45 小鼠小鼠肿瘤自发率高 其自发性肿瘤无论是从组织发生 临床过程以及组织形态学上都与人类的肿瘤接近 所以小鼠目前广泛用于癌 肉瘤 白血病以及其它恶性肿瘤的研究 进行抗肿瘤药物筛选 小鼠自发性肿瘤模型优于移植性肿瘤模型 动物肿瘤体内实验方法动物的选择 46 裸鼠裸鼠是一种独特的纯系动物 全身无毛 先天性无胸腺 T淋巴细胞缺乏 细胞免疫功能缺乏 对异体移植几乎无免疫排斥反应 可接受异系 异种肿瘤肿瘤移植等 有 活试管 之称 自从1969年Rygaard Povlesev二氏将人类肿瘤异种移植于裸鼠首次获得成功后 它在肿瘤研究中已被广泛利用 目前移植于裸鼠较为成功的人类肿瘤有 结肠癌 乳腺癌 肺癌 卵巢癌 宫颈癌 白血病等 动物肿瘤体内实验方法动物的选择 47 裸小鼠的费用昂贵 饲养时对实验室的条件要求高 小鼠不易大量繁殖 因而一般不用于药物的初筛选研究 由于先天性免疫缺乏 因而在一般情况下也不用于免疫药物的研究 裸鼠的缺点 动物的选择 48 C57BL 6小鼠小鼠类的一种 黑毛 体型小 性情较温顺 易于饲养管理 对药物敏感性好 为研究Lewis肺癌所选小鼠 费用适中 饲养条件不太高 易大量繁殖 因而一般可用于药物的体内初筛选研究 Lewis肺癌为C57BL 6小鼠来源的肿瘤 动物的选择 49 大鼠大鼠也广泛用于肿瘤研究 与小鼠相比 大鼠的体型较大 供给的组织较多 便于进行手术等实验操作 大鼠的肝脏对致癌物质很敏感 可用二乙基亚硝胺 二甲基偶氮苯 DAB 复制大鼠肝癌动物模型 还可用甲基苄基亚硝胺诱发大鼠食管癌动物模型 大鼠的自发性癌变的发生率较低 动物的选择 50 金黄地鼠 金黄地鼠是肿瘤学实验研究中最常用的动物 她广泛用于研究肿瘤的增殖 致癌 抗癌 肿瘤转移 康癌药物的筛选等 豚鼠 曾被认为是很少发生肿瘤的动物 近年发现豚鼠也可发生自发性肿瘤 例如支气管乳头腺瘤 白血病等 两栖类动物 蛙类无毛 光滑的皮肤与人类接近 可为皮肤癌的研究提供实验模型 鸟类 鸡和其它鸟类对肿瘤病毒的研究具有极高的实用价值尤其是对于造血系统和间叶组织肿瘤病毒株具有易感性 鱼类 鱼类也可发生不少自发肿瘤 它们对化学致癌物十分敏感 例如用黄曲霉素 二乙基亚硝胺等可诱发鱼类肝脏肿瘤和肾母细胞瘤 其它 许多家畜如马牛羊猪犬猫家兔等都可发生各种肿瘤 动物肿瘤体内实验方法动物的选择 51 动物肿瘤体内实验方法 实验动物的选择 移植性动物肿瘤模型 自发性动物肿瘤模型 诱发性动物肿瘤模型 52 动物肿瘤体内实验方法 移植性动物肿瘤模型 人体肿瘤动物体内移植模型的建立 实体瘤动物体内移植模型的建立 非实体瘤动物体内移植模型的建立 53 移植性动物肿瘤模型 人体肿瘤动物体内移植模型的建立 用人的肿瘤细胞通过移植的方法移植到适合的动物宿主体内 建立一个移植宿主的体内模型 通过该模型对实验药物进行药理药效学观察 人体肿瘤动物体内移植可观察癌细胞对药物的敏感性试验 药物对癌细胞的逆转作用 药物对癌细胞的增殖抑制作用和诱导癌细胞的凋亡等作用 54 移植性动物肿瘤模型 人体肿瘤动物体内移植模型的建立 动物要求 肿瘤细胞来源 肿瘤细胞冻存与复苏 肿瘤细胞体内接种 55 人体肿瘤动物体内移植模型的建立 由于人和动物不同种 存在移植排斥反应 故要用免疫缺陷动物 如裸鼠 裸小鼠是一种独特的纯系动物 全身无毛 先天性T细胞缺乏 对异种肿瘤移植几乎无免疫排斥反应 可接受人类肿瘤移植 裸大鼠无胸腺 缺少T细胞 故能成功地移植异种皮肤和异种肿瘤 包括小鼠肿瘤及人肿瘤 动物要求 56 小白鼠 裸鼠 57 人体肿瘤动物体内移植模型的建立 人体肿瘤细胞的来源大致可分为两类 一类是人的癌细胞株 可从细胞库或其他实验室得到 另一类是源于人体肿瘤组织块的癌细胞 主要从临床肿瘤患者体内获得 为了使肿瘤细胞能得到长期使用和保持不同代的肿瘤组织的本来特性 防止退化或变异 对肿瘤细胞的冷冻保存是很必要的 一般情况下 液氮冻存1 2年后 细胞存活率可达80 90 涉及细胞冻存与复苏技术 肿瘤细胞的来源 58 1 消化洗涤将对数增殖期的细胞或腹水瘤细胞经消化脱壁后 用培养液洗涤l次 2 冻存细胞配制含有保护剂 10 15 的DMSO 甘油等 的培养液作为细胞冻存液 以肿瘤细胞在细胞冻存液中的密度为l l07 ml左右悬浮细胞 将细胞悬液加入到2ml塑料冻存管内 密封后注明标记 将冻存管放入4 或 30 低温冰箱内2h后 移入液氮罐内长期保存 3 冻存细胞的复苏将冻存肿瘤细胞的冻存管从液氮罐内取出 立即置于37 40 温水中 使冻存细胞在lmin内全部融化 1000r min离心l0min 弃去上清液 用新鲜培养液稀释到所需细胞数 再进行培养 慢冻快融原则 人体肿瘤动物体内移植模型的建立冻存与复苏方法 59 1 体外培养扩增无菌条件下 将复苏的肿瘤细胞体外培养 扩增 2 制备细胞悬液在对数生长期 用0 05 胰蛋白酶和0 02 乙二胺四乙酸 ethylenediaminetetraaceticacid EDTA 消化1 2min 倾出消化液 加入无血清1640液洗涤 离心 计数 用无血清1640液或无菌生理盐水配成浓度为1 107 ml的细胞悬液 3 接种肿瘤细胞在无菌环境中 消毒皮肤 用lml注射器抽吸取0 2ml细胞悬液 约含2 106个肿瘤细胞 接种在裸鼠右前肢根部 腋窝 皮下 约1周左右局部就长出花生米粒大小瘤块 4 饲养 观察在无菌环境中饲养 观察 观察瘤块生长情况 定期测量瘤体的直径 最后剥瘤称重 计算抑制率 接种步骤 人体肿瘤动物体内移植模型的建立 60 动物肿瘤体内实验方法 移植性动物肿瘤模型 人体肿瘤动物体内移植模型的建立 实体瘤动物体内移植模型的建立 非实体瘤动物体内移植模型的建立 61 移植性动物肿瘤模型 实体瘤动物体内移植模型的建立 小块瘤体接种法肿瘤细胞悬液接种法培养细胞动物体内移植法 瘤体测量方法 接种方法 主要特点 62 实体瘤动物体内移植模型的主要特点 1 一群动物同时接种等量同种癌细胞 肿瘤生长速度比较一致 个体差异较小 2 接种的成活率高 接近100 3 对宿主的影响较相似 易于客观判断疗效 4 可在同种或同品系动物中连续移植 长期保留 供试验用 5 试验周期一般较短 试验条件易于控制 实体瘤动物模型主要用来筛选抗肿瘤药物 63 移植性动物肿瘤模型 实体瘤动物体内移植模型的建立 小块瘤体接种法肿瘤细胞悬液接种法培养细胞动物体内移植法 瘤体测量方法 接种方法 主要特点 64 小块瘤体接种法 从动物剥离取出肿瘤后 剔除非肿瘤组织和坏死组织 选取生长良好而无变性坏死 呈淡红色 黑色素瘤则呈黑色或黑紫色 鱼肉状的瘤组织 切成2mm 2mm 2mm的小块 在所选宿主动物的腋下剪开一个小口 用无钩眼科镊子夹取小块 送入切口内皮 如何保证切成的小块是2mm 2mm 2mm 为什么接种在腋下 因为腋下部皮肤松弛 能使肿瘤生长得较大 可延长宿主动物的寿命 实体瘤动物体内移植模型的接种方法 65 肿瘤细胞悬液接种法 将选取的肿瘤组织放入玻璃匀浆器中 用无菌生理盐水研磨后 经滤网过滤成单个的细胞悬液 用台盼蓝染色法计数活细胞数 每个接种点皮下注射0 2ml 含1 l06 1 l07个细胞 每只动物可选用一个或多个接种点 通常接种于腋下部皮下 在无菌条件下操作 实体瘤动物体内移植模型的接种方法 66 1 研磨方向及转速制备肿瘤细胞悬液时 在人工研磨时必须使研磨杆向同一方向转动 不可反向交替研磨 防止磨破肿瘤细胞 如果采用电动研磨 一定要控制好转速 以免破坏完整的肿瘤细胞 2 细胞数细胞数多少适中 如果瘤细胞数过多 接种后瘤体生长过快 不便于药物作用的观察 瘤细胞数过少 会导致接种失败 接种部位不能形成肿瘤 接种失败后再在原动物体内重新接种也难成功 必须重新更换动物 为什么 肿瘤细胞悬液接种注意事项 67 将培养至快要融合的单层细胞 对数生长期 用0 25 的胰蛋白酶消化脱壁以后 经用PBS或生理盐水以1000r min经l0min离心洗涤2次后 洗掉细胞中胰蛋白酶和培养液中血清等成分 用台盼篮染色法计数活细胞数 用生理盐水将肿瘤细胞稀释成1 l06 1 l07 ml 每个接种点皮下注射0 2ml细胞 细胞悬液可置于冰上 培养细胞动物体内移植法 实体瘤动物体内移植模型的接种方法 68 移植性动物肿瘤模型 实体瘤动物体内移植模型的建立 小块瘤体接种法肿瘤细胞悬液接种法培养细胞动物体内移植法 瘤体测量方法 接种方法 主要特点 69 实体瘤动物体内移植模型 实体瘤瘤体测量方法 测量实体瘤生长的方法有多种 主要包括测定肿瘤的质量 体积或直径等 70 瘤体测量方法 通常于停药之后次日处死动物 立即剥离取出瘤块 剔除其他组织后称重 若对照组小鼠肿瘤平均小于1g或20 小鼠的瘤重小于400mg 表示肿瘤生长不良 在治疗期间给药组小鼠死亡率大于20 或平均体重下降 自身对照 超过15 者 表示药物毒性反应 应适当减量重复试验 比较试验组与对照组瘤重的差异 按下列公式计算肿瘤抑制率 肿瘤抑制率 100 称量肿瘤的质量 当中药组的瘤重抑制率大于30 需重复试验 连续数次疗效稳定 并经统计学处理有显著性差异时 则评定此药有一定疗效 71 瘤体的直径与肿瘤的大小及质量成正比 测量瘤体的直径不需要处死动物 可用来动态观察瘤体的变化 方法 用游标千分卡尺测量肿瘤的相互垂直的直径 取它们的平均值即为平均直径 MD 100 MD为肿瘤平均直径 A B C为实体肿瘤3个相互垂直的直径 一般用毫米为单位 由于测量的厚度包括皮肤在内 故瘤体越小 产生的误差也就越大 注意由同一实验者测量 瘤体测量方法 测量肿瘤的直径 72 动物肿瘤体内实验方法 移植性动物肿瘤模型 人体肿瘤动物体内移植模型的建立 实体瘤动物体内移植模型的建立 非实体瘤动物体内移植模型的建立 73 非实体瘤动物模型的建立 小鼠 6 7周龄 体重18 22g 组间平均体重相差不宜超过1g 健康 纯种 杂种或杂交第一代 同一种性别 一般用雌性动物接种 接种方法 取出小鼠接种第5 7d的腹水 用生理盐水将细胞浓度稀释为1 l06 1 l07 ml 每只小鼠腹腔注射0 2ml细胞悬液即可 腹水瘤传代 腹水瘤的传代方法与移植接种方法一样 需注意的是动物的年龄与体重对腹水会产生影响 也是导致数据离散的主要原因 腹水瘤移植接种方法 74 给药方法 常用皮下注射 腹壁皮下注射或灌胃 不宜腹腔注射 给药方案 一般每天给药l次 疗程7 10d 亦可每天给药数次 或间歇给药 给药剂量 如有LD50资料可供参考时 一般每日可用1 3 1 5LD50的剂量 动物数 实验组一般为6 10只 对照组数目可根据试验组多少决定 亦可参考下列公式 对照组鼠数 实验组鼠数 操作时间 接种操作时间应尽可能短 不应超过半小时 炎热季节应注意降温 可在瘤源周围置以冰块 其它 严格无菌操作 瘤源污染常导致整批实验失败 实验记录应尽可能详细 可参考1978年全国抗癌研究协会制定的抗肿瘤药物体内筛选规程 腹水瘤移植实验注意事项 75 腹水瘤的测量方法是对小鼠进行每天1次的体重称量 一般在疗程结束后次日称体重 逐日记录 然后进行自身对照或用空白对照 观察比较体重变化 非实体瘤动物模型的建立 腹水瘤测量方法 对照组通常在2 3周内死亡 若治疗期间对照组动物死亡 20 或其20 存活时间长于4周以上 实验均应作废 治疗组观察时间一般为50d左右 按下列公式计算生命延长率 生命延长率 100 76 非腹腔给药时生命延长率 50 腹腔给药时生命延长率 75 则认为有苗头 连续3次疗效稳定 则评价此药有一定疗效 非实体瘤动物模型的建立 疗效判断标准 77 动物肿瘤体内实验方法 移植性动物肿瘤模型 人体肿瘤动物体内移植模型的建立 实体瘤动物体内移植模型的建立 非实体瘤动物体内移植模型的建立 78