肿瘤血管生成及检测ppt课件

肿瘤血管生成及检测 1 人体肿瘤大部分为实体瘤 solidtumors 实体瘤瘤组织由瘤细胞和间质构成 后者主要包括血管 淋巴管 结缔组织 炎细胞及细胞外基质等成分 其中 血管和结缔组织起营养 支持瘤细胞的作用 2 肿瘤内的新生血管和淋巴管分别通过血管生成 angiogenesis 和淋巴管生成 1ymphangiogenesis 实现的 并在肿瘤的生长和扩散 侵袭和转移 中起重要作用 已有研究证明 肿瘤血管生成活跃程度对组织病理分级 放射治疗以及在预后判断上都有重要的评估价值 3 第一节肿瘤血管生成的基本过程一 血管生成现象 一 血管生成的概念1945年Algire提出了 肿瘤血管生成 tumorangiogenesis 或 血管新生化 neovasclarzation 概念 对血管生成重要性的认识 特别是提出 肿瘤生长依赖于血管生成 观点 始于1971年Folkman对肿瘤血管生成的研究报道 4 血管生成是指活体组织在已存在的微血管床上芽生 sprouting 出新的以毛细血管为主的血管系统的过程 有别于胚胎时期由早期内皮细胞分化形成新血管的过程即血管形成 vasculogenesis 二 血管生成的研究方法鸡胚绒毛尿囊膜试验角膜移植实验 5 开窗实验动物移植瘤等在体模型三维胶分析法细胞联合培养等离体模型识别内皮细胞的免疫学标记物 第8因子相关抗原 factor relatedantigenF Ag CD3l CD34 CDl05血管生成因子 VEGF及其受体家族FGF家族及其受体Ang和Tie受体家族Angiotropin血小板源内皮细胞生长因子 PD ECGF 6 二 肿瘤血管生成的基本过程 一 血管生成的基本过程血管生成的基本步骤是 血管生成因子的产生过多使之与抑制因子失衡 导致内皮细胞激活 产生血管生成表型 血管部位细胞外基质改变 基底膜降解 内皮细胞芽生 增殖和迁移 7 新生内皮细胞索形成管状毛细血管襻及管腔 新生血管管腔的贯通 内皮细胞凋亡 脱离基底膜和血管壁细胞改变可能是血管消退的主要病理学事件 二 肿瘤血管生成的过程1 肿瘤生长的阶段性 无血管期 avascularphase 或称血管前期 prevascularphase 肿瘤直径不超过1 2mm 8 血管期 vascularphase 肿瘤迅速生长并发生转移2 肿瘤血管的起源肿瘤中的血管可能有3种来源 血管生成 以两种方式发生 一是肿瘤细胞团先处于无血管期生长 后因缺氧而产生大量血管生成因子 从而诱导血管生成 另一种是瘤细胞先依赖宿主组织已存在的血管生长 继而出现瘤内血管消退 然后再因缺氧诱导血管生成因子作用而发生血管生成 血管套叠性生长 9 内皮祖细胞3 肿瘤血管生成的过程瘤细胞和巨噬细胞血管生成因子 VEGF等 小血管毛细血管伸展内皮细胞迁移形成毛细血管芽新生毛细血管形成并连通 10 第二节肿瘤微血管形态和生物学特性肿瘤微血管不仅在形态上不同于正常血管 而且在生物学功能上也有其特殊性 一 肿瘤微血管形态表现肿瘤组织内新生的微血管一般遍布整个肿瘤组织 但分布上并不均一 血管生成最活跃 微血管密度最高的区域被称为所谓 血管热点区 hotspots 这也是进行肿瘤微血管密度测定的选择区域 很多肿瘤的微血管新生主要分布在肿瘤生长活跃的边缘 11 肿瘤的新生血管分布上常常无规律 分支紊乱 管腔不规则 可表现为狭窄 扩张或扭曲 新生血管呈血窦状 条索状 管壁薄 甚至仅有一层内皮细胞 或管壁很厚 但结构上仍然不完善 内皮细胞 般比较幼稚 细胞间常有裂隙 且缺乏基底膜 有时血管外的肿瘤细胞可直接与血管管腔相连 肿瘤血管的结构缺陷是这些血管具有高通透性的结构基础 也是肿瘤转移途径之一 12 不同类型肿瘤间质的血管没有本质区别 但在形态和数量上却有不同 生长活跃的恶性肿瘤常富于血管 如内分泌肿瘤 肾癌 骨肉瘤 绒毛膜癌 破骨细胞瘤 胶质母细胞瘤和肝细胞癌等 而硬癌 软骨瘤和软骨肉瘤中血管甚少 不同肿瘤血管的形态又有一定的差异 如胶质母细胞瘤中新生血管不仅丰富 而且内皮细胞呈不同程度的增生 肥大 绒毛膜癌 肝细胞癌等血管呈壁薄 明显扩张的血窦 13 以恶性胶质瘤为例 肿瘤组织内新生血管的主要表现形式有 梭形内皮细胞呈索状排列 枝状分布 有或无明显的血管腔 呈原始 幼稚的微血管 内皮细胞增生 肥大 管腔狭小 呈现厚壁血管 内皮细胞增生 形成球形血管壁内血管 呈现 肾小球样结构 管腔大 管壁较薄的相对较大的微血管 并形成血管心假菊形团结构 大量管壁退变和钙化的新生血管 14 增生血管丛呈蛇形密集排列 形成肿瘤与瘤周组织间的血管屏障 血管内皮区域性极度增生 呈片状的梭形细胞 构成 假肉瘤化 二 肿瘤微血管的生物学特性 低反应性 高通透性 低供氧能力 15 最近 VogelsteinB和KinzlerKW采用基因表达的系列分析 serialanalysisofgeneexpressionSAGE 方法 比较研究了结直肠癌和正常肠黏膜血管内皮细胞的基因表达差异 结果发现 二者基因表达存在差异 他们得到了79种差异表达的转录子 其中TEM8仅表达于肿瘤内皮而不表达于黄体形成中的内皮细胞 提示肿瘤血管生成和生理状态下的血管生成有明显不同 这一发现为血管生成的基础和临床研究提供了重要资料 也引起了血管生成和肿瘤治疗研究者的重视 16 第三节肿瘤血管生成的调控机制肿瘤血管生成受多种血管生成因子 angiogenicfactors 和血管生成抑制物 angiogenesisinhibitors 的调控 肿瘤细胞 内皮细胞和巨噬细胞受缺氧刺激等使局部微环境发生变化的因素作用而合成和释放大量血管生成因子从不同环节促进血管生成 组织中同时也存在内源性血管生成抑制因子 对血管生成起抑制作用 17 一 血管生成因子血管生成的始动需要血管生成因子 一系列血管生成因子 细胞因子 细胞外基质和黏附分子及其抑制物 以及代谢性和机械性因子均参与了血管生成过程 已知的血管生成因子有数十种 其中VEGF和Ang家族是已知的 特异性作用于内皮细胞的生长因子 在血管生成中作用可能也是最为重要的 18 一 VEGF及其受体家族1 VEGF家族及其爱体VEGF又称血管通透性因子 vascularpermeabilityfactor VPF 为分子量34 45kD的同源二聚体糖蛋白 属于碱性蛋白 VEGF基因通过转录水平的剪切 可产生5种变异体 即VEGF206 VEGFl89 VEGFl65 VEGFl45和VEGFl21 分别由206 189 165 145和121个氨基酸组成 19 其中以VEGF165最具特征性 其次是VEGF121二者均为可溶性分泌蛋白 扩散力强 易于到达靶细胞 近年又发现其他一些与VEGF功能相似 结构上有一定同源性的多肽因子 包括胎盘生长因子 placentorgrowthfactor PIGF VEGF B VEGF相关因子 VEGF relatedfactor VRF VEGF C VEGF相关蛋白 VEGF relatedprotein VRP 以及VEGF D FIGF和VEGF E等成员 它们共同构成VEGF家族 20 VEGF受体包括VEGFR 1 Flt 1 VEGFR 2 Flk 1 KDR 和VEGFR 3 Flt 4 2 VEGF及其受体的作用 早期血管的形成需要VEGF的调节 它们与内皮细胞上相应的酪氨酸激酶受体结合 引起内皮细胞分裂和分化 并形成管腔样结构 在胚胎发育过程中 VEGF 主要是VEGF A 通过其受体VEGFR 1 Flt 1 和VEGFR 2 Flk 1 KDR 促进内皮分化 增殖 迁移和原始血管形成 21 由新形成的内皮组装成管腔样结构需要VEGFR 1的表达和激活 而VEGFR 3的表达与内皮细胞形成静脉或淋巴管有关 VEGF不仅是内皮细胞特异的强效有丝分裂原 而且能促进内皮细胞产生并调节纤溶酶原激活物及其抑制因子 增加血管通透性等特性 在血管生成中发挥重要作用 VEGF在几乎所有的人体肿瘤和肿瘤细胞株中皆有过表达 VEGF及其受体在肿瘤中的表达常与肿瘤分化程度密切相关 22 大多数实体瘤VEGF基因均有过表达 VEGF165VEGF121两种VEGF最常见 在VEGF家族中 VEGF C和VEG D既可诱导血管生成 又可诱导淋巴管生成 已有研究报道 人体多种肿瘤细胞高表达VEGF C 体内转基因实验也证实 肿瘤细胞VEGF C的高表达能选择性地诱导肿瘤组织淋巴管生成 肿瘤组织中的VEGF C和VEGF D还来源于浸润的巨噬细胞 23 缺氧是包括胶质瘤细胞在内的许多细胞系产生VEGF的一个强烈的诱导因子离体条件下 葡萄糖缺乏亦是VEGF表达的诱因 VEGF在肿瘤坏死灶周边常呈强表达 肿瘤中诱生型一氧化氮合酶 iNOS 表达水平常与VEGF呈正相关 NO与VEGF之间具有相互调节作用 多种癌基因的激活通过上调VEGF表达而诱导血管生成 失活的抑癌基因 如突变型p53基因 也参与了VEGF介导的血管生成过程 24 二 FGF家族及其受体1 FGF家族目前研究最为深入的是碱性戒纤维细胞生长因子 bFGF 和酸性成纤维细胞生长因子 aFGF bFGF和aFGF在结构上是相关的 二者之间有53 的序列同源 2 FGF的分布和生物学作用bFGF是体内分布广泛的生长因子之一 可在不同肿瘤中表达 包括膀胱癌 神经胶质瘤 肝癌 胃肠癌 乳腺癌 肾细胞癌和甲状腺癌等许多培养的细胞系都可以合成它 25 其功能具有多样性 可促进内皮细胞的有丝分裂 趋化性和迁移 刺激内皮细胞产生胶原酶降解基底膜 诱导来源于中胚层和神经外胚层细胞的增殖和分化 bFGF也表现出亲神经性行为 促进神经元的存活和分化 bFGF和aFGF均与肝素有很强的亲和力 研究表明这种高亲和力对于FGF与细胞表达的受体结合是非常重要的 26 3 FGF受体bFGF的生物学作用是通过与其特异性的细胞表面受体FGF受体 FGFreceptors FGFR 结合而介导实现的 已经识别4种FGFR 包括FGFR 1 flg FGFR 2 bek FGFR 3和FGFR 4 FGFR 1在bFGF FGFR系统中的作用最大 正常脑神经元和胶质细胞中FGFR 1的表达呈现明显的异质性 即组织中有些细胞呈现FGFR 1阳性 有些则显示阴性 血管内皮细胞亦是如此 27 三 AngiotropinAngiOtropin是一个含铜离子的4 5kD核酸与多肽的聚合物 将angiotropin加入到已汇合的毛细血管内皮细胞培养基中 它以剂量依赖方式刺激内皮迁移并快速排列成管样结构 这种效应对内皮细胞是特异的 由于它是巨噬细胞产生的化学调节剂 所以它可能启动炎症和伤口愈合中的血管生成过程 28 四 血小板源内皮细胞生长因子 PD ECGF PD ECGF是一个酸性45kD单链多肽 它是内皮细胞特异的有丝分裂素 能刺激人和猪的内皮细胞增生 用PD ECGF转染肿瘤细胞 其裸鼠移植瘤血管密度明显增加 五 其他血管生成因子Ang和Tie受体家族EGFTGF粒细胞集落刺激因子 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 G CSF GM CSF 29 七 降解基底膜的相关物质血管基底膜的降解是血管生成过程中的重要事件 只有基底膜降解之后 内皮细胞才能迁移入周围组织并形成血管芽 基底膜的降解是一复杂过程 涉及一系列酶的作用 这些酶包括基质金属蛋白溶酶 尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活因子 urokinase typeplasminogen u PA 丝氨酸蛋白酶 serineproteases 细胞外蛋白体 proteasome 糖苷酶 endoglycosidases 组织蛋白酶 cathepsins 和多形核白细胞丝氨酸蛋白酶 serineproteinase 30 u PA的作用涉及肿瘤的血管生成与侵袭过程 U PA使纤维蛋白溶酶原转为纤维蛋白溶酶 后者能降解基质蛋白并激和几种基质金属蛋白酶 八 细胞外基质和基质黏附受体在血管生成型中不但需要细胞因子与相应受体的结合 细胞外基质 extraceIlularmatrix ECM 也起着重要作用 内皮细胞独自在接受生长因子的刺激时只表现增生 而在有细胞外基质的条件下 内皮细胞才能形成管腔样结构 31 二 缺氧对血管生成的诱导作用缺氧是肿瘤和非肿瘤性疾病血管生成的重要刺激因素 缺氧诱导的相关转录因子包括缺氧诱导因子 1 2 hypoxiainducingfactor l 2 HIF 1 HIF 2 和NF B 其中以HIF l在血管生成中的作用最为重要 在肿瘤组织中 缺氧一方面可导致瘤细胞死亡 另一方面也刺激残留瘤细胞上调血管生成因子的表达 32 第四节血管生成的有关检测方法一 肿瘤血管生成的体内研究动物模型肿瘤血管生成体内研究的生物试验模型主要有动物 大鼠 兔等 眼角膜囊 眼前房 地鼠颊囊 裸鼠外耳皮下和鸡胚绒毛尿囊膜 CAM 等四种动物模型 国内学者对这四种模型均有研究 有研究认为CAM是研究血管生成较好的实验模型 其方法简便二成本低 仪器设备条件要求不高 易于操作 便于推广 并可用于进行大样本研究 或用于影响血管生成的因素或药物的筛选和评价 因此 特将CAM试验方法作简单介绍 33 鸡胚绒毛尿囊膜 CAM 实验 1 鸡胚准备和接种组织 选择北京白鸡种蛋 洗净 用l 1000苯扎溴铵 新洁尔灭 液浸泡3分钟 置37 8土0 5 培养箱中孵育 鸡胚发育第7天 蛋壳消毒后 标记制作2cmX3cm左右观察窗 接种组织视研究目的而定 一定要在接种当日取材 充分清洗除去血污和粘液 再剪成1 2mm组织小块 2 组织接种 在制备鸡胚观察窗的次日 即鸡胚发育第8天进行组织接种 每个鸡胚可接种5 7个组织小块于接种部位CAM表面 再用透明胶纸封好 继续孵育 34 3 接种组织的收获与观察 组织接种后每12小时观察一次 到组织接种第11天 鸡胚发育第18天 收获接种组织 取出鸡胚 置接种组织连同周围的CAM于解剖显微镜下观察 并用10 甲醛固定保存 部分组织可作石蜡切片 用作血管生成研究的免疫组化染色等 4 CAM的血管生成表现 组织接种24小时后 CAM血管开始向接种组织生长 随培养时间的延长 血管数目及直径均明显增加 第2天 新细小血管直接趋向组织 35 第3天 新生血管形成以接种组织为中心 10 20条放射状血管网 尔后 CAM血管继续明显增加 非接种部位与接种部位比较 CAM血管数目少 大血管与小血管呈脉样均匀分布 而接种部位的CAM血管在接种组织周围弥散样增加 以组织为中心向周围呈放射状分布 在首先与组织发生联系的区域CAM血管更多 第4天 可见新生细小CAM血管生长形成中 粗血管 并在中 粗血管继续分支出细小血管 形成新的血管网 CAM血管管腔结构清晰 可区别动 静脉 36 5 CAM血管生成实验模型的用途 CAM血管生成模型用于血管生成的研究 可取得两方面结果 检测评价接种物刺激CAM血管增生的血管生成作用 用于分析研究血管生成促进因子 抑制因子的活性和作用的检测 如肿瘤血管生成的研究等 对接种物 如肿瘤组织 自身的血管生成进行研究 用于分析不同组织的血管生成活性和作用 如肿瘤组织有引发新生血管生成的作用 37 对照 抗血管生成药物作用以后 38 尽管血管生成的体内动物模型研究更为接近人体的生理状态 使研究结果更为可靠 但Kathryn等认为仍有一些不足之处 如操作繁琐 耗时过长 另外 在该类模型中 血管生成物必须植入眼角膜囊 颊囊 或绒毛尿膜囊使之诱导血管生成 难免产生人为因素诱导的血管生成 血管生成促进因子 抑制因子等需要从多聚载体中释放出来 操作方法和测定其结果的技术较为复杂 由于这些不利之处 最近 Kathryn等又建立了一种新的血管生成模型 二 人胎盘血管培养实验 体外 Kathryn等认为不但既往的体内血管生成实验研究模型有上述不足之处 而体外的血管生成实验研究也主要是内皮细胞的长期培养 将内皮细胞置于细胞外基质环境 或者暴露于各种血管生成刺激因子 使之诱导其血管形成 39 该类体外实验研究 有很多人为因素影响 不能代表体内生理反应 因为内皮细胞在生长因子存在的条件下培养了很长一段时间 已被激活 因此 有必要建立一类与体内生理反应有关的血管生成实验方法 尤其是与人类血管生成有关的血管生成实验 于是 Kathryn等建立了一种新的人血管生成模型 从自愿选择剖腹产手术24小时之内的人胎盘顶端表面截取约长2 5cm 直径为l 2mm的表浅血管 洗去血污 浸入Hank平衡盐溶液中 40 培养在48孔培养板中进行 可在孔中分别加入各种血管生成因子 再加l99培养基 将血管片段在凝固前迅速加入培养孔中央 理想的是使血管片段悬浮于培养胶中 然后将培养板置37 保湿孵育培养14 21天 每周换培养基2次 用减数成相系统计 算原来血管条生成的血管索数量 每隔一天计数新生长形成的微血管条数 由此描绘微血管生长曲线 41 用免疫组化 流式细胞仪 电镜等分别检测了CD34 Weibel Palade小体标志物等 证实新生血管中含有内皮细胞 该实验模型不需要加外源性生长因子 并用该模型检测研究了aFGF bFGF 三种VEGF异构体及其受体在原代血管生长及子代新生血管形成中的作用 结果表明该模型是筛选人类血管生成潜在激活增强因子和抑制因子行之有效的体外实验模型 42 三 肿瘤微血管密度计数 MVD 用F 因子单克隆抗体在组织切片上进行免疫组织化学染色 血管内皮细胞呈棕黄色 MVD计数按Weidner等的方法并加以改动 先在低倍视野内找到MVD最高的区域 然后在高倍视野内计数微血管的数目 分辨不清或染色模糊的细胞不计入结果 单个的棕黄色内皮细胞或细胞簇作一个血管计数 但肌层较厚及血管腔面积 8个红细胞直径的血管不计数 计5个视野的IMVD 取其平均值作为IMVD 43 四 肿瘤血管生成调控因子的检测以VEGF为例 根据实验条件和需要可以从蛋白质水平或核酸水平进行检测 一 免疫组织化学检测用VEGF单克隆抗体在组织切片或细胞爬片上进行免疫组织化学染色 肿瘤细胞胞浆呈棕黄色 44 培养的子宫内膜癌细胞VEGF阳性表达 45 培养的脑星形细胞瘤细胞VEGF阳性表达 46 培养的脑星形细胞瘤细胞VEGF阳性表达 47 二 Westernblot基本原理 免疫印迹又称Western印迹 Westernblot 与DNA的Southern印迹技术相对应 两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体 通常为NC膜 然后用探针检测特异性组分 不同的是 Westernblot所检测的是抗原类蛋白质成分 所用的探针是抗体 它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应 该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点 具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测 以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性 该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记 48 Westernblot的过程分四阶段a 蛋白样品的制备及蛋白样品浓度测定b SDS 聚丙烯酸胺凝胶电泳 SDS PAGE c 蛋白质的电转移 转膜 d 靶蛋白的免疫学检测 杂交 1 蛋白样品的制备及蛋白样品浓度测定A 样品的制备组织的处理方法 组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS 0 研磨 加入5 STOPbuffer 180W 6mins 0 超声波破碎 5000rpm 5mins离心 取上清 加入 ME 9 5ml加入0 5ml 溴酚蓝 9 5ml加入0 5ml 煮沸10min 分装后于 20 保存 用时取出 直接溶解上样 49 细胞的处理方法 离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5 STOPbuffer 收集 180W 6mins 0 超声波破碎 5000rpm 5mins离心 取上清 加入 ME 9 5ml加入0 5ml 溴酚蓝 9 5ml加入0 5ml 煮沸10min 分装后于 20 保存 用时取出 直接溶解上样 分泌蛋白的提取 直接收集分泌液 加入 ME 溴酚蓝制样 B 蛋白的定量方法 a 双缩脲法 b Lowry法 c 紫外吸收法 e Bradford比色法 50 2 SDS 聚丙烯酸胺凝胶电泳 SDS PAGE A 实际操作做胶前的准备1 检查是否有足够的 干净的spacer comb和架子 2 检查是否有新鲜的 足量10 APS 没有立刻重配 3 按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小 计算出胶的浓度 并算出分离胶各组分的用量 制胶 电泳1 装好架子 2 按照 配方配制分离胶 在胶上面加入一层蒸馏水 促进胶更好的凝集 3 待分离胶凝集后 配制浓缩胶 51 倒好浓缩胶后插入预先准备好的梳子 4 待胶凝集好后 上样 电泳 上层胶用60 80V电压 当样品至分离胶时 用100 120V电压 一般电泳时间在1 5小时左右 注意事项及常遇到的问题1 分离胶不要倒的太满 需要有一定的浓缩胶空间 否则起不到浓缩效果 2 上样蛋白量不应超过样品槽 3 gel通常在0 5 1h内凝集最好 过快表TEMED APS用量过多 此时胶太硬易龟裂 而且电泳时容易烧胶 太慢则说明两种试剂用量不够或者系统实际不纯或失效 52 4 混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合 导致电泳带畸形 太慢不均匀 特别是甘油 5 电泳中常出现的一些现象 条带呈笑脸状 原因 凝胶不均匀冷却 中间冷却不好 条带呈皱眉状 可能是由于装置不合适 特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡 或者两边聚合不完全 拖尾 样品溶解不好 纹理 纵向条纹 样品中含有不溶性颗粒 条带偏斜 电极不平衡或者加样位置偏斜 条带两边扩散 加样量过多 53 3 蛋白质的电转移 转膜 在电流的作用下 使蛋白质从胶转移至固相载体 膜 上 膜的选择 印迹中常用的固相材料有NC膜 DBM DDT 尼龙膜 PVDF等 我们选用PVDF 聚偏二氟乙烯 其具有更好的蛋白吸附 物理强度 以及具有更好的化学兼容性 54 转膜有2种方法 A 半干法即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间 通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流 起到转移的效果 因为电流直接作用在膜胶上 所以其转移条件比较严酷 但是其转移时间短 效率高 1 实验条件的选择电流1mA 2mA cm2 我们通常100mA 膜 按照目的蛋白分子大小 胶浓度选择转移时间 具体可以根据实际适当调整 55 目的蛋白分子大小 kDa 胶浓度转移时间 h 80 1408 1 5 2 025 80101 515 40120 75 20150 52 实验操作 1 滤纸和膜的准备 在电泳结束前20分钟应开始准备工作 a 检查是否有足够的transferbuffer 没有立即配制b 检查是否有合适大小的滤纸和膜 56 c 将膜泡入甲醇中 约1 2分钟 再转入transferbuffer中 d 将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入transferbuffer中 2 转移a 在电转移仪上铺好下层滤纸 一般用三层 b 将膜铺在靠膜滤纸上 注意和滤纸间不要有气泡 再倒一些transferbuffer到膜上 保持膜的湿润 c 将胶剥出 去掉stackgel 小心的移到膜上 d 剪去膜的左上角 在膜上用铅笔标记出胶的位置 e 将一张靠胶滤纸覆盖在胶上 倒上些transferbuffer 再铺两张靠胶滤纸 f 装好电转移仪 根据需要选定所需的电流和时间 g 转移过程中要随时观察电压的变化 如有异常应及时调整 57 58 3注意事项及常遇到的问题1 滤纸 胶 膜之间的大小 一般是滤纸 膜 胶 2 滤纸 胶 膜之间千万不能有气泡 气泡会造成短路 3 因为膜的疏水性 膜必须首先在甲醇中完全浸湿 而且在以后的操作中 膜也必须随时保持湿润 干膜法除外 4 滤纸可以重复利用 上层滤纸 靠膜 内吸附有很多转移透过的蛋白质 所以上下滤纸一定不能弄混 在不能分辨的情况下 可以将靠胶滤纸换新的 5 转移时间一般为1 5小时 1mA 2mA cm2 10 gel 可根据分子量大小调整转移时间和电流大小 B 湿法这里暂不做介绍 59 C 转移后效果的鉴定1 染胶用考马斯亮兰染色经destain脱色后 看胶上是否还有蛋白来反映转移的效果 2 染膜有两类染液选择 可逆的和不可逆的 可逆的有ponceau sred FastgreenFC CPTS等 这类染料染色后 色素可以被洗掉 膜可以用做进一步的分析用 但是不可逆的染料 如考马斯亮兰 indiaink Amido black10B等 染色后膜就不能用于进一步的分析 60 4 靶蛋白的免疫学检测 杂交 a 用0 01MPBS洗膜 5min 3次 b 封闭 block 封闭是为了使我们的抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合 常用的封闭液有 bovineserumalbumin BSA non fatmilk tween 20等 我们一般用non fatmilk 在转移结束前配好5 的Milk TBST溶解 转移结束后将膜放入milk中block 一定要放在干净的容器里 避免污染而且要足以覆盖膜 并清洗整理好用过的滤纸 以便下次使用 Block4 C1小时 61 c 弃封闭液 用0 01MPBS洗膜 5min 3次 d 加入一抗 按合适稀释比例用0 01MPBS稀释 液体必须覆盖膜的全部 4 放置12hr以上 阴性对照 以1 BSA取代一抗 其余步骤与实验组相同 e 弃一抗和1 BSA 用0 01MPBS分别洗膜 5min 4次 f 加入辣根过氧化物酶偶联的二抗 按合适稀释比例用0 01MPBS稀释 平稳摇动 室温2hr g 弃二抗 用0 01MPBS洗膜 5min 4次 h 加入显色液 避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应 62 63 注意事项 1 一抗 二抗的稀释度 作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件 2 显色液必须新鲜配置使用 最后加入H2O2 3 DAB有致癌的潜在可能 操作时要小心仔细 三 RT PCR检测VEGF的mRNA表达 64 谢谢 65