目的基因获得ppt课件

第二章基因工程的基本条件 一 用于核酸操作的工具酶二 基因克隆载体三 目的基因的获得四 基因工程受体菌或细胞 三 目的基因的获得 限制酶酶切直接分离法PCR扩增法从mRNA合成cDNA化学合成法通过构建基因文库分离法 对已克隆在载体中的目的基因 可根据目的基因两侧的限制酶识别序列 选择适当的限制酶酶切 获得目的基因 一 限制酶酶切直接分离法 注意 目的基因内部不能有该限制酶的切点 否则目的基因会被切成碎片 二 PCR法扩增目的基因 利用耐热DNA聚合酶的反复作用 通过变性 退火 延伸的循环操作 在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的操作技术 PCR polymerasechainreaction 以目的基因为模板 合成互补的新DNA链 双链DNA解链为单链DNA 引物与模板单链DNA的特定互补部位配对 结合 退火 变性 延伸 变性 退火 延伸 30thcycle 由于每一循环所产生的DNA片段均能成为下一次循环的模板 故PCR产物以指数方式增加 即Y 2n n为循环次数 230 109 copies PCR技术的发明 DNA操作技术的革命 1983 03开汽车时的联想 蜿蜒崎岖的山路 DNA双螺旋行驶的汽车 一小段DNA引物 1972在加州大学伯克利分校获得博士学位1979进入私人生物技术公司Cetus 1983 08正式做有关PCR原理的报告1983 09Mullis开始动手做实验1984 11首次取得可信结果1985 01RandallSaiki加入 结果毋庸置疑 1985 03Cetus公司申请专利1985 12 SaikiRK ScharfSJ FaloonaFA MullisKB HornGT ErlichHA ArnheimN Enzymaticamplificationofbeta globingenomicsequencesandrestrictionsiteanalysisfordiagnosisofsicklecellanemia Science 1985 230 4732 1350 4 1986 05冷泉港 人类分子生物学 专题研讨会1987 01 MullisKB FaloonaFA SpecificsynthesisofDNAinvitroviaapolymerasecatalyzedchainreaction MethodsinEnzymology 1987 155 335 50 1991 12Cetus以 3亿将专利卖给Hoffmann LaRoche公司 1986 06Saiki等将耐热DNA聚合酶 Taq酶引入PCR技术 SaikiRK GelfandDH StoffelS ScharfSJ HiguchiR HornGT MullisKB ErlichHA Primer directedenzymaticamplificationofDNAwithathermostableDNApolymerase Science 1988 239 4839 487 91 1988 01 1989Science杂志将PCR列为十余项重大科学发明之首 比喻1989年为PCR爆炸年 1986 09Mullis离开Cetus公司 EppendorfBio radABI PCR法扩增目的基因的前提 已知目的基因全序列或其两侧序列 化学合成与模板互补的上 下游引物 Taq酶无3 5 外切酶活性 无阅读校正功能 在扩增过程中会引起错配 30次循环Taq酶错配率约0 25 措施 问题 可能造成目的基因碱基序列的改变 原因 选择高保真Taq酶 如Pfu 因Taq酶对dATP具有优先聚合活性 5 A A PCR扩增产物 5 由Taq酶扩增的PCR产物 3 末端总是带有一个非模板依赖型的突出碱基 而这个碱基几乎总是A 三 从mRNA合成cDNA 以目的基因的mRNA为模板 在逆转录酶作用下合成cDNA第一链 然后在Klenow酶作用下合成双链cDNA 此法适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆 如血红蛋白珠蛋白基因 哺乳动物的网织红细胞中珠蛋白mRNA的比例占总mRNA的90 以上 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的0 5 以下 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的50 90 高丰度mRNA 低丰度mRNA 步骤 钓取目的基因的mRNA 1 提取特定组织或细胞的总RNA 用oligo dT 纤维素柱分离总mRNA 2 根据已知基因序列合成DNA探针 结合到纤维素柱上 用来分离纯化特定mRNA 克隆平端双链cDNA的方法 平端直接与载体连接 平端接同聚尾 加装人工接头 adapter 加装衔接物 linker 加装同聚物尾 利用TdT 在双链cDNA和载体3 端加互补的同聚物尾 退火连接成重组分子 1972年 斯坦福大学P Labban和P Kaiser发明 加装人工接头 adapter 1978年 康奈尔大学吴瑞发明 将adapter连接到双链cDNA的两端 直接成为人工粘端 CIP去除adapter的5 P 使5 P成为5 OH 措施 加装衔接物 linker linker是人工合成的一段由10 12个核苷酸组成 具有一个或多个限制酶识别序列的平末端双链寡核苷酸短片段 EcoRIlinker 将双链cDNA与linker连接 再用限制酶酶切 可产生粘性末端 四 化学合成法 已知目的基因的DNA序列 化学合成法的前提 小片段粘接法补钉延长法大片段酶促法 战略 化学合成的DNA片断一般局限在200bp以内 1 小片段粘接法 2 补钉延长法 3 大片段酶促法 化学合成的份额较大 成本较高 大片段化学合成的收率极低 如合成50bp的DNA单链大片段的总收率仅7 7 三种方法各有利弊 化学合成DNA的单链片段愈短 收率愈高 化学合成的份额较小 成本较低 化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去 每接一个单体就是一个循环反应 包括 基团保护 分离 缩合 分离 去保护五大操作单元 DNA合成仪是根据固相亚磷酰胺三酯法原理设计的 从反应机理上来讲 DNA化学合成有磷酸二酯法 磷酸三酯法 亚磷酰胺三酯法 具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式 DNA合成仪 基因合成一般都是自己设计序列 交给商业公司合成 DNA化学合成的用途 合成天然基因修饰改造基因设计新型基因合成测序或PCR引物制备寡核苷酸探针制备人工接头 adaptor 和衔接物 linker 合成天然基因 有些组织特异性mRNA含量很低 很难用cDNA法克隆 有些基因比较短 化学合成费用较低 如 生长激素释放抑制激素基因 脑啡肽基因 胰岛素基因 干扰素基因等 合成寡核苷酸探针 oligonucleotideprobe 根据已知核酸序列 用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段 作为探针使用 若未知核酸序列 可根据蛋白质的氨基酸序列倒推出核酸序列 但需考虑 密码子的简并性 大多数氨基酸拥有简并密码子 五 通过构建基因文库分离目的基因 是特定生物体全基因组的集合 天然存在 基因库 是从特定生物个体中分离的全部基因 这些基因以克隆形式存在 人工构建 基因文库 根据构建方法的不同 基因文库分为 基因组文库 cDNA文库 含全部基因 含全部蛋白质编码的结构基因 鸟枪法构建 材料来自染色体DNA cDNA法构建 材料来自mRNA 1 基因组文库 1 基因组DNA的制备 制备的DNA分子量越大 切割后含不规则末端DNA片段的比率越低 重组率和完备性越高 基因组文库的构建 为最大限度保证基因的完整性 基因组DNA在分离纯化操作中应避免过度断裂 常规方法制备的染色体DNA长度一般100kb 如先将细胞固定在低熔点琼脂糖凝胶 再置于含SDS 蛋白酶K RNase的缓冲液中浸泡 可获得1 000kb的DNA片段 一般采用超声波和限制酶部分酶切法 保证DNA片段大小均一 2 基因组DNA的切割 保证DNA片段之间存在部分重叠区 超声波处理 处理后的DNA片段呈平末端 需加装人工接头 产生粘性末端 可与常用克隆位点 如BamHI BglII 连接 部分酶切法 部分酶切片段大小可控 可得到15 45kb的随机片断 3 载体和受体的选择 构建大型基因组文库 动植物和人类 选择BAC或YAC 根据载体 选择E coli Yeast 常选 DNA或Cosmid 在基因组文库构建中 最应引起重视的问题 尽量提高载体与外源DNA片段的连接效率 根据载体的装载量 将DNA片段分级分离 利用CIP 去除载体的5 P 利用TdT 在DNA片段的3 OH加同聚尾 基因文库的完备性 是指在构建的基因文库中任一基因存在的概率P 与基因文库最低所含克隆数N的关系 N ln 1 P ln 1 f P 基因文库的完备性 某一基因被克隆的概率 f 克隆片段平均大小 生物基因组大小 N ln 1 P ln 1 f 如 人单倍体DNA长2 9 106kb 克隆片段平均大小15kb 构建完备性0 9的基因文库 至少需45万个克隆 当完备性提高至0 9999时 至少需180万个克隆 即 为保证某一基因以99 99 的机率至少被克隆1次 需构建含180万个不同重组克隆的基因文库 这时克隆片段总和为整个基因组的倍 9 3 即 为保证某一基因以99 99 的机率至少被克隆1次 需构建含180万个不同重组克隆的基因文库 若1个基因文库的插入片段总和为整个基因组的10倍以上 就能从基因文库中调出任何一段DNA序列 基因文库的质量标准 除尽可能高的完备性外 理想的基因文库还应具备 重组克隆能稳定保存 扩增 筛选 克隆总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力 载体的装载量必须大于基因的长度 含有相邻DNA片段的重组克隆之间 需存在足够长度的重叠区 以利于克隆排序 克隆片段易于从载体分子上完整卸下 基因组文库的保存 影印滤膜保存法 保存文库于液体培养基中 保存单个克隆子于液体培养基中 1 影印滤膜保存法 2 保存文库于液体培养基中 从平板上挑取全部克隆 接种于含适当抗生素的液体培养基中 混合的细菌生长数代后 加入终浓度25 的甘油 70 保存 缺点 由于文库菌落生长的不均匀性 可能导致文库中某些特定序列过多或过少 3 保存单个克隆子于液体培养基中 从平板上挑选单个克隆 接种于含适当抗生素的液体培养基中 菌体生长至一定浓度时 加入终浓度25 的甘油 70 保存 缺点 需保存的克隆子数过多 工作量大 从基因组文库中筛选目的基因 大型基因组文库由数十万甚至上百万个重组克隆组成 除一些具特殊功能的蛋白质编码基因 如抗药性基因 可用特殊的正选择筛选程序 如抗药性筛选 直接筛选外 一般均需多轮操作步骤 根据目的基因已知核苷酸序列进行筛选 通过构建基因组文库获取目的基因的问题 该方法仅适用于原核基因的分离 较少采用 不能除去真核生物目的基因的内含子结构 工作量大 需了解目的基因的背景知识 不能获得最小长度的目的基因 鸟枪法 shotgun 又称 散弹法 用 鸟枪法 获取目的基因 缺点 操作简便 工作量大 具有一定的盲目性 优点 优点 保证目的基因的完整性 提高目的重组子的出现频率 简化操作 鸟枪法操作的改进 使用特定限制酶完全酶切染色体DNA 前提 已知目的基因的酶切图谱 策略 用目的基因两端的限制酶完全酶切染色体DNA 然后与载体拼接 如 已知目的基因位于1 8kb的SalI片段中 将染色体DNA用SalI切开 琼脂糖凝胶电泳分离 切下1 6 2 0kb区域内的凝胶块 从此凝胶中回收DNA片段 与载体连接 基因组文库重组克隆的排序 构建大型基因组文库技术上并不困难 若文库插入片段总和为基因组的10倍以上 就能从其中调出任何一段DNA序列 然而基因文库的克隆是随机序列 必须将所有克隆排列成一个像天然染色体DNA上所表现出的信息顺序 这项工作的工作量远大于文库构建 酶切片段末端标记法随机探针联合杂交法染色体走读法 基因组文库重组克隆的排序方法 酶切片段末端标记法 1 将单一YAC克隆插入DNA片段用限制酶均匀地水解成若干片段 末端标记同位素 H H H H 载体DNA 克隆DNA 2 然后用Sau3A将末端标记的DNA片段降解成碎片 PAGE电泳 每10个YAC克隆走在一块板上 形成10个克隆的特征性DNA指纹图谱 3 电脑分析指纹图谱 如发现任何两个克隆DNA的指纹图谱有部分相同 二者就有互相重叠的可能性 在染色体上则可能是排列一起的 10克隆指纹图谱 12345678910 随机探针联合杂交法 1 将若干YAC克隆固定在薄膜上 复制20份薄膜 合成20种不同序列的短探针 序列随机 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 ABCDEFG 2 用20种探针随机定位杂交 1对1 20份YAC克隆薄膜 若某2个克隆同时对同一种探针呈现杂交阳性反应 则这2个克隆有可能相互重叠 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 ABCDEFG 20个随机探针 3 若将杂交阳性结果记为 1 可清晰地列成一张表 最终排出上述YAC克隆的排列顺序 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 D A B C E F G 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 从基因文库中任取1个克隆作为染色体走读的起点 将其两端序列分别亚克隆 亚克隆片段在0 5 2 0kb范围内 染色体走读法 chromosomewalking 走读的起点克隆片段 亚克隆旁测序列 2 以亚克隆DNA片段为探针 与基因文库杂交 阳性克隆中的插入DNA片段必定与起点克隆所含的DNA片段连锁在一起 3 再以阳性克隆片段的两端序列为探针 进行第二步走读 直至线型染色体DNA的端点 阳性克隆 阳性克隆 第二轮杂交 第二轮杂交 将某种生物基因组转录的全部mRNA通过反转录合成cDNA 与载体连接 转化宿主细胞 得到含全部表达基因的克隆群体 2 cDNA文库 信息量远小于基因组文库 容易构建 具有时空性和组织细胞特异性 cDNA文库的特点 不含内含子序列 可以在细菌中直接表达 包含该生物全部蛋白质编码的结构基因 在高度分化的生物体中 不同组织或细胞在相同时段 相同环境背景下 mRNA种类 表达水平也不同 同一组织或细胞在不同时段 不同环境背景下 mRNA种类 表达水平不同 具有时空性和组织细胞特异性 cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中 在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因 因此具有时空性和组织细胞特异性 cDNA文库的构建 总RNA提取 1 总RNA提取 商业化试剂盒 利用mRNA含polyA尾 将其从总RNA中分离纯化 mRNA只占总RNA的1 2 2 mRNA的分离纯化 商业化oligo dT 纤维素柱 哺乳动物mRNA长度为0 5 8 0kb 大部分为1 5 2 0kb 3 cDNA第一链的合成 cDNA第一链 mRNA AAAAAAAAAAAAAA3 AAAAAAAAAAAAAA3 TTTTTTTTTTTTTTT5 AAAAAAAAAAAAAA3 TTTTTTTTTTTTTTT5 引物 退火 逆转录酶 dNTPs 4 cDNA第二链的合成 自身引导法 置换合成法 引导合成法 自身引导法 获得的双链cDNA5 端会有几对碱基缺失 置换合成法 TTTTTTTTTTTTTT5 获得的双链cDNA5 端也会有几对碱基缺失 引导合成法 获得的双链cDNA能保留完整的5 端序列 载体和受体的选择 选择E coli 选择plasmid 因绝大多数真核生物的mRNA 10kb 受体 载体 从cDNA文库中筛选目的基因 根特异性表达的目的基因差显杂交筛选法示意图 通过构建cDNA文库获取目的基因的问题 仅限于克隆蛋白质编码基因 并非所有的mRNA分子都具有polyA结构 细菌等原核生物的mRNA半衰期很短 mRNA在细胞中含量少 对酶和碱极敏感 分离纯化困难