白血病分子诊断技术ppt课件

白血病分子诊断技术 1 WH0血液肿瘤分类方案 1999年 新分类方案的基本原则是 结合形态学 免疫表型 遗传改变和临床特征来鉴定疾病的 真实本质 提供了疾病分类与治疗选择和预后判断的较明确关联性 开启了血液肿瘤靶向性治疗和个性化方案的新时代 形态学 免疫学 细胞遗传学 2 WH0血液肿瘤分类方案 2008年 组织 蛋白 细胞 基因 3 白血病分子诊断的意义 精确诊断准确预后指导治疗科研资料 白血病初发 MICM诊断 系统诊断 异常标记 残留监测 靶向治疗 4 WHO血液肿瘤新分类实验技术平台 实施WHO血液肿瘤新分类方案高度依赖流式细胞 细胞遗传和分子生物学实验技术平台以及更为重要的掌握这类实验技能并具有血液肿瘤专业知识的血液病理学医师 遗传工作站 流式细胞 基因平台 5 基因检测 融合基因基因突变 6 二次打击 学说 D GaryGillilandBestPractice16 409 417 基因突变 融合基因 白血病发生 7 CMLIndicationsforDiagnosticTestsMilestonesandMonitoringinPatientswithCMLTreatedwithImatinib 2008ASHEducationProgramBookp420 TestIndicationPhysicalExamDiagnosis StagingEverythreemonthuntilresolutionofsplenomegalySuspectedprogressionorresistanceCompleteBloodCountDiagnosis StagingEvery1 2weeksuntilbloodcounthavestabilized thenat6weeksintervalsSuspectedprogressionorresistanceBoneMarrowKaryotypingDiagnosis Staging6 12 18monthsoruntilcompletecytogeneticresponseSuspectedprogressionorresistanceQuantitativePCRforBcr AblEverythreemonthsonceCCyR completecytogeneticresponse documentedFISHforBCR ABLUncertainDiagnosis typicalclinicalpresentation butmetaphase peripheralblood cytogeneticsnotsuccessful orPhchromosomenegative Every3monthsifnoaccesstohighquantitativePCRmonitoringQualitative lowsensitivity UncertainDiagnosis typicalclinicalpresentation butmetaphasePCRforBCR ABLcytogeneticsnotsuccessful orPhchromosomenegative BCR ABLKinaseMutationScreenSuspectedprogressionorresistance 8 MolecularMeasurementsofTreatmentResponse ClinicalApplication 2008ASHEducationProgramBookp367 ApplicationActionDetectpoorearlytreatmentresponseTreatmentintensificationDetectgoodearlytreatmentresponseTreatmentdeintensificationDetectrelapseTreatmentintensificationPrepareforHSCTMeasureMRDbeforeHSCTOptimizetimingofHSCTMeasureMRDafterHSCTModulateimmunosupressionDLI etc MeasureMRDatendofclinicaltrialEvaluatetheresultofnovelanti ALLagentsortherapy 9 分子诊断在白血病诊断中的应用 提供早期辅助诊断及预后判断对治疗过程进行跟踪进行白血病治疗后的微小残留检测 10 各病例中的具体应用 AMLCMLALLCLL淋巴瘤 11 AML病例中应用 t 8 21 q22 q22 AML1 ETOt 15 17 q22 q21 PML RARainv 16 p13 q22 CBFB MYH11AML融合基因全套检测FLT3基因突变检测NPM1基因突变检测c kit D816V突变检测CEBPA基因突变检测WT1基因表达定量检测 12 t 8 21 q22 q22 AML1 ETO融合基因 t 8 21 出现在大约7 的AML病例中 在年青的患者中更为常见 其主要出现在AML M2这一亚型中 大约有20 40 的病例具有t 8 21 AML1 ETO融合基因出现在所有的t 8 21 阳性的AML中 同时也出现在具有复杂易位的t 8 21 阴性的AML病例中 t 8 21 易位是一个较好的标志 13 14 PML RAR APL是一类临床凶险的急性白血病 常见广泛的严重的出血 以颅内出血最为严重 1 t 15 17 是APL特有的遗传学标志 70 90 的APL存在 2 由于PML基因上融合位点的不同 分为bcr1 55 bcr2 4 bcr3 40 三种融合型 3 PML RARa融合基因 的患者 可使用全反式维甲酸并提示预后复发 该基因阳性的病人 可用于疗效监测和微小残留的检测 15 16 inv 16 p13 q22 CBFB MYH11融合基因 Inv 16 p13 q22 或t 16 16 p13 q22 通常见于AML M4Eo亚型 占总AML患者的10 inv 16 p13 q22 的病人通常有较好的预后 17 18 AML相关基因全套筛查 19 20 基因突变检测 AML患者预后判断C Kit FLT3 NPM1 CEBPA 染色体核型正常的AML患者 CEBPA 15 21 MolecularMarkersadditionaltocytogeneticswithindependentprognosticsignificancesasregardingremissiondurationorsurvivalinAMLofadultsAML ChallengeofCapturingDieseaseVariety 2008ASHEducationProgramBookp3 PrognosisGeneGenemutationwithCEPBAmutfavorableimpactNMP1mutbutFLD3 ITDnegGenemutationwithKITunfavorableimpactFLD3 ITDbutnoNMP1mutMLL PTD 5 10 ofnormalkaryotypeAML WT 1 amongnormalkaryotypeAML 22 AML患者4种基因突变检测小结 23 WT1定量检测 MDS AML监测指标 WT1基因在AML和MDS病人中经常异常高表达 与AML和MDS的发生和进展 以及凶险判断 疗效跟踪和预后复发判断有非常密切的关系 通过定量PCR检测WT1的表达能够有助于AML和MDS病人的风险判断 疗效跟踪和预后复发的判断 24 25 WT1在正常标本和AML病例中的表达情况 正常骨髓 患者骨髓 26 27 基因检测 CMPD诊断 28 在WHO2008分类系统中 将有无JAK2突变列为主要的诊断指标 如果JAK2突变阳性 血红蛋白增加 骨髓红系细胞明显增加 就可以诊断真性红细胞增多症 PV 即使患者就诊时血红蛋白低于以往WHO所规定的指标值 但却持续超过正常值20g l 也可以确诊PV 如果JAK2突变阳性 血小板仅仅持续大于450 109 L 骨髓巨核细胞增生 可以诊断原发性血小板增多 ET PV ET诊断 29 FIP1L1 PDGFRA部分高嗜酸性粒细胞综合征 HES 患者含有FIP1L1 PDGFRA融合基因 FIP1L1 PDGFRA有持续活化的酪氨酸激酶活性 对酪氨酸激酶抑制剂非常敏感 可用格列卫治疗 ETV6 PDGFRB有少部分CMPD病例 BCR ABL阴性 的PDGFRB基因持续性活化表达 格列卫能够特异性的抑制ETV6 PDGFRB的酪氨酸激酶活性 携带该融合基因的CMPD病例可以选择格列卫治疗 30 CML病例中的应用 BCR ABL融合基因检测 t 9 22 q34 q11 BCR ABLp210t 9 22 q34 q11 BCR ABLp230BCR ABL融合基因ABL激酶突变检测 31 BCR ABL融合基因 超过95 的CML病例中存在BCR ABL融合基因P210型M bcr 绝大多数 b3 a2 55 b2 a2 40 b3 a2和b2 a2 5 b3 a3 罕见 b2 a3 罕见 p230型u bcre19 a2 罕见 32 定性检测 RT PCR 定量检测 QRT PCR 33 定性检测报告模板 34 定量检测报告 35 BCR ABL融合基因ABL激酶突变检测 ABL激酶突变会引起伊马替尼治疗耐药T315I耐药机制 T315突变后不能与伊马替尼形成关键性的氢键 可完全阻断伊马替尼与ABL激酶区的结合 从而耐药 P环的突变 244 255 耐药机制 如Y253F H E255K V Q252H G250E等通过改变ABL激酶的空间构象 亦可阻碍伊马替尼与之结合 36 A环突变 381 402 一般提高用药量可以降低耐药程度 其它突变对于耐药程度较弱的突变 如M244V G250E F317L E355G F359V及V379I等 通过提高药物剂量 可以克服耐药 37 报告模板 38 ALL病例中应用 t 1 19 q23 p13 E2A PBX1t 4 11 q21 q23 MLL AF4t 12 21 p13 q22 TEL AML1t 9 22 q34 q11 BCR ABLALL相关基因全套检测 39 t 1 19 q23 p13 E2A PBX1融合基因 t 1 19 q23 p13 易位可以在5 6 的儿童ALL病例和3 的成人ALL病例检测到 这一易位几乎全部出现在前B细胞ALL病例中 携带有该易位的病人 其临床症状都比较凶险 40 t 4 11 q21 q23 MLL AF4融合基因 在50 70 的婴幼儿ALL和将近5 的小儿和成人ALL病例中有MLL AF4融合基因 t 4 11 q21 q23 与前B ALL相关 在婴幼儿ALL中MLL AF4融合基因被认为是预后不好的标志 在成人ALL中也是一个坏的标志 但对于成人ALL 该融合基因的存在似乎能增强高剂量的阿糖胞苷 Ara c 的疗效 41 t 12 21 p13 q22 TEL AML1融合基因 t 12 21 p13 q22 是儿童ALL中最为常见的易位 几乎25 的小儿ALL有该易位 其主要的阳性病人出现在1 12岁之间 其中2 5岁这个年龄段最多 所有的病例其免疫分型都是前B细胞ALL t 12 21 阳性的病人都有较好的预后 其复发的时间也会较晚 42 t 9 22 q34 q11 BCR ABL融合基因 Ph染色体在5 的小儿ALL和20 50 随年龄增加比例也增加 的成人ALL中也可见 在Ph 的ALL中40 的BCR ABL融合基因是p210型的 60 是p190型的 在ALL中 PH阳性和随之出现的BCR ABL融合基因是一个非常不好的标志 43 ALL相关基因全套检测 44 45 CLL病例中的应用 IgVH基因重排检测 IgVH突变状态 按照细胞IgVH的突变状态可以将CLL分为突变的CLL M CLL 与未突变的CLL U CLL 前者预后较好 而后者则疾病进展快 生存期短 46 IgVH基因重排阳性的CLL患者预后较好 47 融合基因套系 48 白血病31种融合基因筛查 49 其它检测项目 TCR IgH重排BCL 1 JH BCL 2 JH检测 50 IGH与TCR重排 淋巴细胞克隆性的检测对鉴别良 恶性淋巴细胞增生有重要的参考价值 单克隆重排 淋巴细胞异常标志多克隆性重排 淋巴细胞正常生长发育 IgH基因 TCR基因 T细胞 B细胞 重排 成熟B细胞 成熟T细胞 51 ALL CLL 淋巴瘤辅助诊断CLL预后判断 52 ALL CLL 淋巴瘤辅助诊断 53 BCL 1 JH检测 BCL 1 JH t 11 14 q13 q32 基因重排主要发生在套细胞淋巴瘤 MCL 当中 在60 70 的MCL病例中有该易位的存在 检测BCL 1 JH基因重排可帮助鉴别诊断套细胞淋巴瘤 54 55 BCL 2 JHt 14 18 易位是B细胞淋巴瘤的特有性变异 90 的滤泡性淋巴瘤和20 30 的弥漫性大B细胞淋巴瘤含有此易位 BCL 2 JH检测 56 57 标本要求 骨髓2 3ml或外周血3 5mL 复发和微小残留的检测 骨髓2 3ml EDTA抗凝 紫头管 4 24h内送检 58 细胞遗传学 染色体核型分析FISH 59 染色体核型分析 适应症1 造血系统疾病初诊2 末次化疗结束两周以上意义对恶性血液病的诊断 分类分型 治疗方案选择 疗效评估和预后预测方面都有重要的价值 46 XY 60 t 9 22 q34 q11 约占95 CMLPh染色体 染色体核型分析 诊断 61 8三体 单独或附加异常 较多见于M1 M4 M5 预后差或中等 46 XY 8 62 FISH检测 荧光标记的DNA探针 原位杂交 荧光显微镜检测 63 FISH相对于染色体检测 灵敏度高 特异性高 可以弥补染色体不足 染色体检测为阴性 FISH可能为阳性 患者用药后 染色体阳性率较低 FISH可提高检出率 染色体核型与FISH 64 变异型 h 复杂遮蔽型 易位 FISH探针 BCR ABL 检测结果nucish9q34 ABL 2 22q34 BCR 2 ABLconBCR 1 200 400 65 正常FISH组合结果 中位生存期约为111个月 FISH探针套系 CLL 66 FISH探针套系 MM 67 FISH探针套系 MDS 68 标本要求骨髓3 5ml 肝素钠抗凝绿头管 全血3 5ml 外周血原始细胞 30 肝素钠抗凝 48小时内 4 送检 详细填写申请单 69 病例一 AML 病例资料 女 3岁 2009 6初发FCM印象 在CD45 SSC点图上设门分析 原始细胞分布区域可见异常细胞群体 约占有核细胞的26 主要表达HLA DR CD13 CD15 CD33 CD34 CD38 CD117 CD19 2 27 淋巴细胞比例降低 提示 急性髓系细胞白血病 AML M2可能 基因 AML1 ETO阳性 70 2009 7化疗D33 FCM 可见残留 CD33 CD19 细胞约占0 04 基因 AML1 ETO阳性 71 2009 9D70 FCM 未做 基因 AML1 ETO阴性 2010 3D245 FCM 未见免疫表型明显异常的细胞 基因 AML1 ETO阴性 72 病例资料 病人陈某 2008年2月在协和医院确诊CML BCR ABL定量检测为阳性 格列卫治疗 病例二 CML 73 74 75 谢谢大家 关注健康关注康圣环球 77