洗涤用酶制剂质量规格及测试方法第二部分脂肪酶编制说明

国家标准洗涤用酶制剂质量规格和测试方法 第二部分 脂肪酶编制说明一、任务来源国家标准洗涤用酶制剂质量规格及测试方法 第二部分 脂肪酶（计划编号20172650-T-607），项目实施周期24个月。本项任务由日化院提出并归口，项目实施周期24个月。诺维信（中国）投资有限公司、XXXX、XXXX等单位起草了本标准。二、目的和意义由于世界范围内人们环保意识的日益加强，消费者的洗涤习惯愈发倾向于短时间、低水温、少水量洗涤，在这种趋势下传统的无酶洗涤剂无法满足消费者日益增长的洗涤去污标准。随着我国洗涤剂行业的不断发展，大部分洗涤剂生产商均在产品内加入一定量的蛋白酶来满足消费者对于草渍、血渍等蛋白类污渍的清除需求。但是，由于中国人有着含丰富油脂的饮食、烹饪习惯，油脂污渍一直以来都是最令人困扰，并且出现频率很高。所以，中国的日化企业也有很强的意愿推出高效去油的洗涤产品。含有脂肪酶的洗涤剂可以满足这种需求，脂肪酶可以更好地去除生活中常见的油脂类污渍。同时对于油脂类污渍，脂肪酶的加入可以在维持甚至提高洗涤效果的同时降低洗涤剂内表面活性剂含量，减少漂洗次数，节水节电，提高能源、资源利用率，有利于环境，符合我国可持续发展方针。 1988年诺维信公司推出了lipolase这款脂肪酶，全球第一款脂肪酶就此问世。但是脂肪酶在洗涤剂中应用是近些年来才开始的。现在市场上的脂肪酶主要是发挥酶制剂的定向去油功效，尤其是对动物油为底物的污渍有不错的去除效果。目前，宝洁，汉高，立白等国内外知名洗涤剂生产商都有脂肪酶的应用。洗衣粉中固体脂肪酶应用比较普遍。但是随着洗衣液的普及，液体脂肪酶在洗衣液中的应用也是提高综合洗净力的不可或缺的力量，洗涤剂生产商也正在积极推出含有脂肪酶的液体洗衣液。洗涤用脂肪酶在我国市场较大，但刚刚起步，亟待制定相应的国家标准规范。近年来不同质量规格的洗涤用脂肪酶产品层出不穷，但至今仍缺乏相应的国家标准对洗涤用脂肪酶的质量进行规范。同时，酶活力检测多为厂家自己开发的方法，不同方法，酶活力的定义和检测方法不同，造成酶活力的数值不同，有的方法酶活力的数值为几十个单位，有的方法酶活力的数值为几万或几十万个单位。因此建立一个统一的酶活力检测方法非常必要。同时酶制剂产品在最终洗涤剂中的性能也是反应产品质量的一个重要指标，因此去污力检测方法的建立也势在必行。三、工作过程2018年5月在太原召开了起草脂肪酶国家标准研讨会，全国表面活性剂洗涤用品标准化中心专家，诺维信（中国）投资有限公司，杜邦(中国)研发管理有限公司，深圳市芭格美生物技术有限公司企业代表提出了许多意见和建议，在此基础上我们编制了洗涤用酶制剂质量规格和测试方法-第二部分 脂肪酶国家标准（初稿）；2018年8月召开小型座谈会讨论初稿，形成第二稿。2018年9 12月，重点对脂肪酶活力检测和去污力检测的方法进行了完善。2019年13月，完成了标准中的方法验证。2019年4月召开了洗涤剂工业专家、学者、企业代表、检验机构的代表等参加的座谈会，修改形成第三稿。2019年6月召开的全国标准化技术委员会会议上进行了讨论，形成了目前的文本，即征求意见稿。四、标准编制原则和主要内容（一）标准编制原则 本标准按照GB/T 1.1标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则及GB/T 1.2标准化工作导则 第2部分：标准中规范性技术要素内容的确定方法的要求进行编写。检测方法主要参考了现行酶活力和洗涤剂去污力测定标准，兼具先进性和可行性。酶活力的检测方法参考了GB/T 23535-2009脂肪酶制剂和QB/T 1803-1993工业酶制剂通用试验方法，同时借鉴了相关的国内外文献。酶去污力的检验方法参考了GB/T 13174-2008 衣料用洗涤剂去污力及循环洗涤性能的测定、GB/T 26398-2017 衣料用洗涤剂去污性能、耗水量与节水性能评估指南 模拟家庭洗涤试验法、QB/T 1224-2012 衣料用液体洗涤剂中关于去污力测试重要指标选取和污布检测方式等。方法建立过程中尽量采用目前酶制剂生产厂商以及洗涤剂生产厂商检测实验室普遍采用的分析技术及仪器，选择准确、可行、便于操作的分析条件，保证检测方法的可操作性和可重复性。（二）标准的主要内容本标准主要包括以下9个部分及附录：（1） 范围（2） 规范性引用文件（3） 术语和定义、符号和缩略语（4） 产品分类（5） 要求（6） 试验方法（7） 检验规则（8） 标志、包装、运输及贮存（9） 保质期附录A： 脂肪酶活力的测定方法附录B： 脂肪酶去污力的测定方法附录C： NZ-01（胡萝卜素猪油污布）的制备附录D： 脂肪酶粒度的测定-筛分法五、主要内容的说明本标准为首次制定，本标准建立了产品标准，同时建立了产品重要的检测方法：脂肪酶活力的测定方法，脂肪酶去污力的测定方法，脂肪酶粒度的测定等。（一）范围 描述了本标准的主要技术内容和适用情况。（二）术语和定义 本标准的术语和定义参照了现行的标准和文献，确定了本标准的术语和定义。（三） 产品分类本标准按照脂肪酶的形态分为两类：液体剂型酶制剂和固体剂型酶制剂。（四）要求1. 感官要求本标准从色泽、气味、状态等方面对感官要求进行了规定。发酵产品由于生产过程比较复杂，每一批产品的颜色会有区别，但是产品颜色的深浅与酶活力的高低没有任何关系，所以在标准中规定了颜色是一个过渡色；同时产品会有一些特殊的“发酵”气味，经常会有客户询问厂家气味的问题，所以在标准中规定了产品可能有发酵气味。同时根据洗涤剂产品行业的特点，固体产品可以根据客户的要求，制成多种颜色。2. 理化要求酶活力是产品的一个重要的理化指标，但同时酶活力也是一个商业指标，厂家可以根据客户的要求，生产出各种酶活力的产品。所以在标准中没有规定酶活力具体的数值。建议这个数值在合同中规定。对于固体产品，规定了产品最小颗粒度指标。根据GB 30000.21-2013化学品分类和标签规范第21部分：呼吸道或皮肤致敏，酶被分类为呼吸致敏物。粉末产品由于本身有很大粉尘，容易造成酶过敏，鉴于粉尘产品存在很大的安全隐患，容易造成操作人员和最终消费者的过敏，所以不建议在洗涤剂中使用。在洗涤剂中的酶制剂产品一般为造粒产品，通过造粒工艺，进行包被的颗粒产品。通过样品检测和厂家内定指标的对比，数值定为粒度F 试验方法115687218010.29600.5894天443118288400.04060.9967以上结果所示，概率F的结果大于0.05，表明两种滴定方法之间没有显著的统计学差异。表11 诺维信样品均值与方法间比值样品均值(酚酞法) CU/g均值(自动滴定法) CU/g比值(酚酞法/自动滴定法)样品11336001272001.05样品752000433001.20表12 发酵院样品均值与方法间比值样品编号均值(酚酞法) CU/g均值(自动滴定法) CU/g比值(酚酞法/自动滴定法)样品11336001326001.01样品752000533000.98(3) 实验结论 从比值来看，诺维信实验室结果里样品7的差别较大，但从发酵院的比值结果来看，几乎没有差别，从诺维信和发酵院不同实验室之间的验证已经证明了两个实验室之间的结果没有明显差异，因此，样品7差别较大是样品本身或者其它原因造成的，两个方法之间是没有显著差别的。7. 不同实验室验证结果(1) 实验介绍此次试验主要是对于现行的脂肪酶国标方法（GB/T 23535-2009）进行优化，实验数据收集主要在中国食品发酵工业研究院与诺维信（中国）生物技术两个实验室进行，根据实验指导，各实验室数据收集已经完成，由诺维信实验室进行数据分析，报告以下部分会展示不同实验室之间和不同样品之间的对比情况。 表13样品活性均值表样品活性（CU/g）发酵院诺维信样品1132600127200样品2120300116400样品3112900104100样品4168800148200样品5146800122000样品6145900138800样品75330043300(2) 样品评估与计算 不同实验室间每个样品数据的离群分析都是通过统计学模型计算的，模型如下所示： Ln(Result) = + 样品 + error. 样品属性设置为标称； 经过模型分析，5#样品第二天的结果（来自诺维信实验室）被判断为离群结果。7#样品第四天的结果（来自诺维信实验室）由于已知的原因被人为判断为离群结果。样品结果对比模型图分别如下：图9：1#样品结果 图10：2#样品结果 图11：3#样品结果 图12：4#样品结果 图13：5#样品结果 图14：6#样品结果图15：7#样品结果 直观视觉判断：7个样品发酵院结果都高于诺维信，有很明显的趋势，除了7#样品外，其他六个样品的差异并不大；杜邦实验室的结果与其他两个实验室相差较大。样品均值与实验室间比值如下表。表14 样品均值与实验室间比值样品编号均值(发酵院)均值(诺维信)比值(发酵院/诺维信)样品11326001272001.04样品21203001164001.03样品31129001041001.08样品41688001482001.14样品51468001220001.20样品61459001388001.05样品753300433001.23 假设两个实验室之间有显著的影响，利用统计学模型：Ln(Result) = + 天 + 实验室 + 实验室*天 + error. 测试结果如下: 表15 效应检验源参数数目自由度平方和F 比率概率FLab1113833915481.24730.2667天4414497655150.32680.8594天*Lab4438230553790.86170.4897 以上结果所示，概率F的结果大于0.05，表明两个实验室之间没有显著的统计学差异。(3) 精密度表16 精密度样品序号发酵院诺维信110.693.8123.074.8533.994.6644.326.79510.015.1068.326.1475.051.25每个样品在不同实验室的变异系数如上图所示；基于发酵院1#和5#样品的变异系数偏大的限制，使用统计学模型来计算方法的精密度为7.34%；方法精密度= ( 0.0074265)*100% = 8.62%。(4) 实验结论根据统计学计算，发酵院和诺维信实验室结果没有显著的差异。该方法重复性较好，可作为标准方法推广使用。 （二） 性能检测方法本标准酶去污力的检验方法参考了GB/T 13174-2008 衣料用洗涤剂去污力及循环洗涤性能的测定、GB/T 26398-2017 衣料用洗涤剂去污性能、耗水量与节水性能评估指南 模拟家庭洗涤试验法、QB/T 1224-2012 衣料用液体洗涤剂中关于去污力测试重要指标选取和污布检测方式等。本性能检测方法建立了一种新的污布，更适合脂肪酶性能的测试。同时分析方法采用标准品对照的方法，使检测数据更为稳定。1. 污布选择 去污力测定是判定洗涤用脂肪酶实际洗涤效果的最重要的判断依据，污布的对于酶的响应、酶剂量相关性以及污布表现的稳定性，对于最终测定的准确性和可重复性至关重要。在现行洗涤相关标准中，油脂类污布种类较少，如GB/T 13174-2008中推荐的JB-04 (大豆油，涤棉) 以及GB/T 26398-2017 中推荐的JBS-40-C (花生油/炭黑，棉)， JBS-40-PC (花生油/炭黑，涤棉) 和JBS-41-C (猪油，棉)污布。经过长期实验发现，这些污布对脂肪酶的响应较差，且偏差较大，不能很好地量化洗涤用脂肪酶洗涤效果。原因主要是由于以上的油脂类污布使用的染色剂不能很好地指示布上残留油脂。故本标准推出了NZ-01 (胡萝卜素猪油，棉) 污布，该污布制作方法与以往油脂类污布类似，具有良好的可操作性。但由于采用了脂溶性的胡萝卜素作为染色剂，该污布对脂肪酶有较好的响应，利于对脂肪酶的真实洗涤效果做出测定。2. 关于脂肪酶去污力测定的结果判定方法（标准洗衣粉对照法） 本标准参考GB/T 13174-2008衣料用洗涤剂去污力及循环洗涤性能的测定中有关去污力判定的描述，建立了标准洗衣粉对照法作为脂肪酶去污力测定的结果判定方法，以含脂肪酶试样标准洗衣粉与标准洗衣粉本身去污力结果的比值P作为判定依据。该方法的采用主要有以下理由：（1）以标准洗衣粉去污力作为参照条件最为稳定，且去污力比值法是之前相关标准的延续，有利于进行推广。（2）在制定标准过程中，通过重复试验，表明了该方法有利于突出脂肪酶对洗涤效果的影响，尽量消除因设备差异、操作方式不同、实验材料批次差异等造成的偏差，从而更好地保证结果的可重复性和可靠性。（3）规定P 1.10的主要理由：一，由下节验证试验可知，市场上广泛认可的脂肪酶制剂样品大部分均能满足甚至大大超过P 1.10，故将标准定为标准洗衣粉去污力的1.10倍既符合现阶段洗涤用脂肪酶制剂的普遍质量要求，又不至于过高，仍有一定的提升空间；二，通过大量试验表明，标准洗衣粉对NZ-01的去污力约为30%，则P 1.10等价于加入脂肪酶后会有约3%的去污力提升。对该种污布来说，约3%以上的反射值差异才能观察到较明显的视觉差异（见图16），而污布的视觉差异是洗涤剂厂商判断是否真正可以提升去污效果的一大考量因素，故以P 1.10是合情合理的，该判定有利于保证脂肪酶制剂产品能够有真正的油脂类污渍洗涤效果，使洗涤剂生产商和消费者获益。(4)规定脂肪酶制剂加量为0.4 w/w%（按洗涤剂重量计）的主要理由是：一，符合目前洗涤剂厂商添加酶制剂的习惯，即按洗涤剂质量分数进行添加，而非按酶活添加。二，不同脂肪酶制剂酶活的高低与其真正的洗涤效果没有必然联系，因为酶活测定仅是通过测定脂肪酶在简化条件下催化底物进行水解反应的速率，而真正的洗涤条件下包括酸碱度，温度，水硬度，表面活性剂含量等均与之有较大差异，酶活较高的脂肪酶分子在洗涤条件下不一定有较好的去污效果，反之亦然；所以本标准固定了脂肪酶的添加剂量而非酶活。 图 16 污布NZ-01 视觉差3. 验证试验 （1）样品从脂肪酶活力检测中选取四个样品，进行去污力的测试。通过预实验得出以下目标活力。表17 内部验证样品选择样品编号样品名称预估酶活力1样品11350002样品21320003样品31050004样品451000注：样品在实验过程中4 冷藏。 （2）方法 该实验方法严格采用标准附录B脂肪酶去污力的测定方法， 使用附录C描述的NZ-01（胡萝卜素猪油污布），进行方法验证。 （3）实验设计 酶加量取市场常见的标准剂量0.4 w/w%(酶制剂/洗涤剂)，共取5个条件，分别是：无酶条件，样品1，样品2，样品3，样品。每个条件由两个不同的实验员分别在两天各重复3次，共重复6次。 （4）样品结果和原始记录 表18 NZ-01（胡萝卜素猪油污布）去污值结果样品酶浓度w/w%天数去污值（R）RSD%总RSD%123标准洗衣粉无131.5930.0529.703.305.76228.8027.2827.303.14样品10.4139.6940.7442.483.455.68237.4236.4438.442.67样品20.4137.8636.4234.694.373.05235.4335.8735.400.73样品30.4134.7936.8934.983.272.50236.5735.1635.262.20样品40.4129.0831.8729.245.214.50228.9827.9428.972.09注：RSD即相对标准偏差，用于评估方法精密度。表19 NZ-01（胡萝卜素猪油污布）去污比值结果样品酶加量w/w%天数去污比值（P）极差标准差CR95(6)平均值总RSD%123标准洗衣粉无11.001.001.000.000.000.001.000.0021.001.001.00样品10.411.261.361.430.170.070.261.354.8521.301.341.41样品20.411.201.211.170.140.060.231.244.6421.231.311.30样品30.411.101.231.180.190.070.301.236.0921.271.291.29样品40.410.921.060.980.140.050.211.015.2421.011.021.06 综合表18,表19的结果来看，NZ-01污布去污值（R）结果和NZ-01污布的去污比值（P）结果均有着较小的偏差和较高的精密度，与传统污布检测方式一致。可见NZ-01污布在本方法下有着较好的稳定性。（三） 粒度分布检测方法厂家在进行粒度分析的时候，一般采用筛分法。针对市场上的固体脂肪酶进行检测，不同厂家的颗粒度分布标准不同，但是所有厂家的造粒产品均能满足粒度150 m 0.5%。分析数字见表20。表20 粒度分布检测结果厂家分析项目数值厂家A粒度150 m0厂家B粒度150 m0厂家C粒度150 m0厂家D粒度150 m0七、技术经济论证及预期的社会经济效果 洗涤用酶制剂质量规格和测试方法-第二部分 脂肪酶为首次制定。酶制剂产品在食品领域，饲料领域建立了相关标准。但是在洗涤剂行业，酶制剂的标准刚刚开始建立。 酶活力的检测一直是酶制剂标准中的一个难点。建立一个统一的酶活力检测方法，可以使洗涤剂厂家在原料接收检验或第三方检测时提供一个依据。 同时，检测酶制剂产品在最终洗涤剂中的性能，也是非常重要的。本标准推荐去污力的检测方法给厂家提供参考。八、重大意见分歧的处理经过和依据 没有重大分歧。九、采用国际标准和国外先进标准情况目前该产品没有国际标准。十、与有关的现行法律、法规和强制性标准的关系与洗涤剂行业相关法律法规、规章协调一致，未发生冲突。十一、贯彻国家标准的要求和措施建议 对本标准中推荐的酶活力检测方法、去污力检测方法，建议由日化院组织实施对相关企业、科研单位、第三方检测机构进行培训。十二、主要参考文献和标准【1】GB/T 23535-2009 脂肪酶制剂【2】GB/T 1803-1993 工业酶制剂通用试验方法【3】GB/T 13174-2008 衣料用洗涤剂去污力及循环洗涤性能的测定【4】GB/T 26398-2017 衣料用洗涤剂去污性能、耗水量与节水性能评估指南 模拟家庭洗涤试验法【5】QB/T 1224-2012 衣料用液体洗涤剂【6】脂肪酶活力测定方法及其比较-2011.12 凯里学院学报 雷启义【7】脂肪酶活力测定方法的改进-通化师范学院学报 2005.11 纪建业【8】脂肪酶活力测定方法的探讨-广州博仕奥集团 尹翠金【9】脂肪酶活力检测方法的比较-药物生物技术 2002.09 高贵【10】橄榄油乳化法测定脂肪酶活性的优化研究-食品工业 2011.06 滕宏飞【11】碱滴定法测定脂肪酶活力影响因素的研究及其在洗涤产品中的应用-日用化学工业 2017.01 杨媛，张剑【12】脂肪酶活力测定方法及其在筛选产脂肪酶微生物中的应用-生物技术通报 2013.01 王欢【13】三种脂肪酶活力测定方法的比较及改进-化学与生物工程 2007.11 江慧芳【14】碱性脂肪酶测定方法探讨-无锡轻工大学学报 1998.11 秦昉【15】碱性脂肪酶与表面活性剂相互作用的研究-工业微生物 2000.06 郑毅