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限制性核酸内切酶 制作人 日期 简介 限制性核酸内切酶 restrictionendonuclease 识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶 别名 Endodeoxyribonuclease 酶反应 限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上 它能识别外源DNA并将其降解 单位定义 在指明pH与37 在0 05mL反应混合物中 1小时消化1 g的 DNA的酶量为1单位 定义和命名 DNA限制性内切酶 生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶 它可以将外来的DNA切断的酶 即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力 但对自己的DNA却无损害作用 这样可以保护细胞原有的遗传信息 由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的 故名限制性内切酶 简称限制酶 限制性核酸内切酶的命名 一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成 第四个字母表示菌株 品系 例如 从BacillusamyloliquefaciensH中提取的限制性内切酶称为BamH 在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶 可以编成不同的号 如HindII HindIII HpaI HpaII MboI MboI等 特征和种类 1 限制与修饰现象早在50年代初 有许多学者发现了限制与修饰现象 当时称作寄主控制的专一性 hostcontrolledspecificity l噬菌体表现的现象便具有代表性和普遍性 其在不同宿主中的转染频率可说明这一问题 表2 1 l在感染某一宿主后 再去感染其它宿主时会受到限制 E coli菌株 噬菌体感染率lKlBlCE coliK110 410 4E coliB10 4110 4E coliC111说明K和B菌株中存在一种限制系统 可排除外来的DNA 10 4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果 此时限制系统还未起作用 而在C菌株不能限制来自K和B菌株的DNA 限制作用实际就是限制酶降解外源DNA 维护宿主遗传稳定的保护机制 甲基化是常见的修饰作用 可使腺嘌呤A成为N6甲基 腺膘呤 胞嘧啶C成为5 甲基胞嘧啶 通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的 2 限制与修饰系统的种类根据酶的亚单位组成 识别序列的种类和是否需要辅助因子 限制与修饰系统主要分成三大类 表2 1是各种限制与修饰系统的比较 型 type 限制与修饰系统所占的比例最大 达93 型酶相对来说最简单 它们识别回文对称序列 在回文序列内部或附近切割DNA 产生带3 羟基和5 磷酸基团的DNA产物 需Mg2 的存在才能发挥活性 相应的修饰酶只需SAM 识别序列主要为4 6bp 或更长且呈二重对称的特殊序列 但有少数酶识别更长的序列或简并序列 切割位置因酶而异 有些是隔开的 s型 type s 限制与修饰系统 占5 与 型具有相似的辅因子要求 但识别位点是非对称 也是非间断的 长度为4 7bp 切割位点可能在识别位点一侧的20bp范围内 型限制酶一般是同源二聚体 homodimer 由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成 每个亚单位作用在DNA链的两个互补位点上 修饰酶是单体 修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成 分别作用于其中一条链 但甲基化的碱基在两条链上是不同的 在 型限制酶中还有一类特殊的类型 该酶只切割双链DNA中的一条链 造成一个切口 这类限制酶也称切口酶 nickingenzyme 如N BstNBI 型 type 限制与修饰系统的种类很少 只占1 能识别专一的核苷酸顺序 并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链 但是切割的核苷酸顺序没有专一性 是随机的 如EcoK和EcoB 其限制酶和甲基化酶 即R亚基和M亚基 各作为一个亚基存在于酶分子中 另外还有负责识别DNA序列的S亚基 分别由hsdR hsdM和hsdS基因编码 属于同一操纵子 转录单位 EcoK编码基因的结构为R2M2S EcoB编码基因的结构为R2M4S2 EcoB酶的识别位点如下 其中两条链中的A为甲基化位点 N表示任意碱基 TGA N 8TGCTEcoK酶的识别位点如下 其中两条链中的A为可能的甲基化位点 AA C N 6GTGC但是EcoB酶和EcoK酶的切割位点在识别位点1000bp以外 且无特异性 型 type 限制与修饰系统的种类更少 所占比例不到1 也有专一的识别顺序 但不是对称的回文顺序 它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链 但这几个核苷酸对则是任意的 如EcoP1和EcoP15 它们的识别位点分别是AGACC和CAGCAG 切割位点则在下游24 26bp处 在基因操作中 一般所说的限制酶或修饰酶 除非特指 均指 型系统中的种类 表2 1 各种限制与修饰系统的比较 限制酶识别的序列 1 限制酶识别序列的长度限制酶识别序列的长度一般为4 8个碱基 最常见的为6个碱基 表2 2 当识别序列为4个和6个碱基时 它们可识别的序列在完全随机的情况下 平均每256个和4096个碱基中会出现一个识别位点 4 4 256 4 6 4096 以下是几个有代表性的种类 箭头指切割位置 4个碱基识别位点 Sau3A GATC5个碱基识别位点 EcoR CCWGG Nci CC SGG6个碱基识别位点 EcoR G AATTC Hind A AGCTT7个碱基识别位点 BbvC CC TCAGC PpuM RG GWCCY8个碱基识别位点 Not GC GGCCGCSfi GGCCNNNN NGGCC以上序列中部分字母代表的碱基如下 R A或GY C或TM A或CK G或TS C或GW A或TH A或C或TB C或G或TV A或C或GD A或G或TN A或C或G或T 2 限制酶识别序列的结构限制酶识别的序列大多数为回文对称结构 切割位点在DNA两条链相对称的位置 EcoR 和Hind 的识别序列和切割位置如下 EcoR G AATTC Hind A AGCTTCTTAA GTTCGA A有一些限制酶的识别序列不是对称的 如AccBS CCGCTC 3 3 和BssS CTCGTG 5 1 识别序列后面括号内的数字表示在两条链上的切割位置 AccBS CCG CTC BssS C TCGTGGGC GAGGAGCA C有一些限制酶可识别多种序列 如Acc 识别的序列是GT MKAC 也就是说可识别4种序列 其中两种是对称的 另两种是非对称的 Hind 识别的序列是GTY RAC 有一些限制酶识别的序列呈间断对称 对称序列之间含有若干个任意碱基 如AlwN 和Dde 它们的识别序列如下 AlwN CAGNNNC TG Dde C TNAGGT CNNNGACGANT C 3 限制酶切割的位置限制酶对DNA的切割位置大多数在内部 但也有在外部的 在外部的 又有两端 两侧和单侧之别 切点在两端的有Sau3A GATC Nla CATG 和EcoR CCWGG 等 在两侧的有Bcg 10 12 CGA N 6TGC 12 10 和TspR CASTGNN Bcg 酶的切割特性与其它酶不同 它们在识别位点的两端各切开一个断点 而不是只产生一个断点 切点在识别位点外侧的还有Bbv GCAGC 8 12 和BspM ACCTGC 4 8 等 Bcg 10 N CGA N 6TGC N 12 12 N CGA N 6ACG N 10 TspR NNCAC G TGNN NNGTG C ACNN 1 限制酶产生匹配粘端 Matchedend 识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后 产生的末端为匹配粘端 亦即粘性末端 cohesiveend 这样形成的两个末端是相同的 也是互补的 若在对称轴5 侧切割底物 DNA双链交错断开产生5 突出粘性末端 如EcoR 若在3 侧切割 则产生3 突出粘性末端 如Kpn EcoR NNG AATTCNNNNCTTAA GNN2 限制酶产生平末端 Bluntend 在回文对称轴上同时切割DNA的两条链 则产生平末端 如Hae GG CC Sma CCC GGG EcoRV GAT ATC 产生平末端的DNA可任意连接 但连接效率较粘性末端低 限制酶产生的末端 3 限制酶产生非对称突出端许多限制酶切割DNA产生非对称突出端 当识别序列为非对称序列时 切割的DNA产物的末端是不同的 如BbvC 它的识别切割位点如下 CC TCAGCGGAGT CG有些限制酶识别简并序列 其识别的序列中有几种是非对称的 如Acc 它的识别切割位点如下 其中GTAGAC和GTCTAC为非对称 GT AT CGACCATA GC TG有些限制酶识别间隔序列 间隔区域的序列是任意的 如Dra 和Ear 它们的识别切割位点分别是CAC NNN GTG和CTCTTC 1 4 4 同裂酶 isoschizomer 识别相同序列的限制酶称同裂酶 但它们的切割位点可能不同 具体可分为以下几种情况 同序同切酶这些酶识别序列和切割位置都相同 如Hind 与Hinc 识别切割位点为GTY RAC Hpa 与Hap 识别切割位点为C CGG Mob 与Sau3A 识别切割位点为 GATC 同序异切酶Kpn 和Acc65 识别的序列是相同的 但它们的切割位点不同 分别为GGTAC C和G GTACC 另外 Asp718 识别和切割位点为G GTACC 同功多位 许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能 如EcoR 识别和切割位点为G AATTC Apo 识别和切割位点为R AATTY 后者可识别前者的序列 另外 Hpa 和Hinc 的识别位点也有交叉 它们的识别和切割位点分别为GTT AAC和Hinc 其它有些限制酶识别的序列有交叉 如在pUC系列质粒的多克隆位点中有一个Sal 位点 识别切割位点为G TCGAC 该位点也可被Acc 识别切割位点为GT MKAC 和Hinc 识别切割位点为GTY RAC 切割 5 同尾酶许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相同的 且是对称的 即它们可产生相同的粘性突出末端 这些酶统称为同尾酶 这些酶切割DNA得到的产物可进行粘端连接 以下几种酶产生的末端是相同的 通过表4 3很容易判断哪些酶可产生相同的DNA末端 EcoR G AATCCMfe C AATTCApo R AATTY Spe A CTAGTNhe G CTAGCXba T CTAGA BamH G GATCCSau3A GATCSty C CWWGG Cla AT CGATAcc GT MKAC pUC19 常见同尾酶总结如下 来自网络 6 识别特殊系列的 prefix和p prefix系列酶有些线粒体 叶绿体 核DNA T偶数噬菌体含有一些编码内切酶的内含子 有些intein proteinsplicingelement 也有内切酶的活性 这两类内切核酸酶称为 prefix和p prefix系列内切酶 它们识别的序列很长 prefix是由在RNA水平上剪切和编码的 p prefix在蛋白质水平上剪切的产物 这类内切酶也称为homingendonuclease 目前商业化的种类有6种 从因特网上可以找到Intein的数据库Inbase InteinDatabase 该网站由NewEnglandBioLabs公司维护 CeuI酶是衣滴虫 Chlamydomonaseugametos 叶绿体大rRNA基因的内含子编码的产物 识别位点为26bp 识别的核心部位为 12至 7位置的19bp 反应温度为37 识别位点如下 方框内为核心识别序列 TAACTATAACGGTC CTAA GGCA DNA末端长度对限制酶切割的影响 限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求 也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸 否则限制酶将难以发挥切割活性 用20单位 Units 限制酶切割1 g标记的寡核苷酸做测试时 发现不同的酶对识别序列两端的长度有不同的要求 表2 3 相对来说 EcoR 对两端的序列长度要求较小 在识别序列外侧有一个碱基对时在2小时的切割活性可达90 而Acc 和Hind 对两端的序列长度要求较大 用DNA片段 线性载体 检测末端长度对切割的影响时 同样发现识别序列的末端长度对酶切效率有明显影响 不同的酶对末端长度的要求是不同 在设计PCR引物时 如果要在末端引入一个酶切位点 为保证能够顺利切割扩增的PCR产物 应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目 另外 了解末端长度对切割的影响还可帮助在双酶切多克隆位点时选择酶切秩序 表2 3 靠近DNA片段末端的切割效率 用寡核苷酸检测 影响酶活性的因素 影响酶切活性的因素有许多 概略的说可分为外因和内因 外因是可预见和控制的 如反应条件 底物的纯度 是否有杂质 是否有盐酚的污染 何时加酶 操作是否恰当 反应体积的选择以及反应时间的长短等等 内因包括位点偏爱性 甲基化底物 底物的构象 构象的影响主要指切割线性DNA和超螺旋DNA时的活性 如与切割 DNA相比 EcoR Pst Sal 需要至少2 5 10倍的酶来切割pBR322的超螺旋DNA PaeRT 与Xho 切割相同的序列 C TCGAG 但如果5 端为CT则PaeRT 不能切割 TransitionalPage Backdrops Thesearefullsizedbackdrops justscalethemup CanbeCopy PastedoutofTemplatesforuseanywhere TitleBackdrop SlideBackdrop PrintBackdrop AdditionalGraphics Scalethemupordown GIFclipartisanimated JPGclipartcanbescaledupandtakeuplittlefilespace PNGclipartcanbescaledunusuallylargewithoutdistortion TransitionalBackdrop