分子生物学实验第四章.ppt

第四章目的基因的获取 目的基因 准备要分离 改造 扩增或表达的基因 第一节基因组DNA片断化 一 限制性内切酶法 用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断 酶切 由于带有粘性末端 产物可以直接与载体连接 1 优点 2 缺点 目的基因内部也可能有该内切酶的切点 目的基因也被切成碎片 BamHI BamHI BamHI gene 二 随机片断化 1 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间 使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开 内切酶识别位点的碱基数 影响所切出的产物的长度和随机程度 1 限制性内切酶的选用原则 1 4bp的内切酶 平均每46 4096 bp一个切点 2 6bp的内切酶 平均每44 256 bp一个切点 随机程度高 如Hae AluI Sau3A 内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连 Sau3A BamHI 2 机械切割法 1 超声波 超声波强烈作用于DNA 可使其断裂成约300bp的随机片断 2 高速搅拌 1500转 分下搅拌30min 可产生约8kb的随机片断 1976年H G Khorana提出了用化学方法合成基因的设想 并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文 第二节化学合成目的基因 一 目前常用的方法 磷酸二酯法 磷酸三酯法 亚磷酸三酯法 固相合成法 自动化合成法 保护dNTP的5 端P或3 端 OH 用酸或碱的脱保护 1 原理 1 磷酸二酯法 带保护的单核苷酸连接 保证合成反应的定向进行 带5 保护的单核苷酸与带3 保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来 2 合成过程 下一个5 端保护的单核苷酸又可以同3 端保护的二核苷酸聚合 原理与磷酸二酯法一样 只是参加反应的单核苷酸都是在3 端磷酸和5 OH上都先连接了一个保护基团 2 磷酸三酯法 将第一个核苷酸的3 OH端固定在固相支持物上 固相磷酸三酯合成法 是目前通用的合成方法 15 合成的二核苷酸连接处有三个酯键 固相磷酸三酯合成过程 固相支持物 结果是全保护的DNA 5 DMT 3 固相支持物 核苷酸之间对氯苯 最后脱保护 固相支持物 固相支持物 C 化学合成的DNA片断一般在200bp以内 二 化学合成DNA片断的组装 用T4多核苷酸激酶使各个片段的5 端带上磷酸 1 互补连接法 预先设计合成的片断之间都有互补区域 不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链 2 5 端磷酸化 1 互补配对 合成的DNA单链的5 端是 OH T4DNA连接酶 T4多核苷酸激酶 使5 OH磷酸化 完整的DNA双链 3 连接酶连成完整双链 2 互补延伸连接法 预先设计的片断之间有局部互补区 可以相互作为另一个片断延长的引物 用DNA聚合酶延伸成完整的双链 3 5 5 3 5 3 T4DNA连接酶 Klenow片段 引物 1 直接合成基因 三 寡聚核苷酸化学合成的优点 2 合成引物 20mer左右 1 mRNA的含量很低 很难作cDNA 3 合成探针序列 4 定点突变合成 合成带有定点突变的基因片断 2 有些基因比较短 化学合成费用较低 DNA合成仪 5 合成人工接头或衔接物 含有各种酶切位点人工接头 Adaptor 或衔接物 Linker 序列 EcoRI EcoRI Linker Adaptor 将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断 并将所有这些片断都与适当的载体连接 引入相应的宿主细胞中保存和扩增 理论上讲 这些重组载体上带有了该生物体的全部基因 称为基因文库 一 基因文库的构建 1 基因文库 genelibrary 第三节目的基因的保存和扩增 2 目前常用的载体 2 构建基因文库的载体选用 载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目 载体容量越大 所要求的DNA片断数目越少 所需的重组子越少 1 对载体的要求 载体系列 容量为24kpcosmid载体 容量为50kbYAC 容量为1MbBAC 容量为300kb 断点完全随机 片断长度合适于载体连接 不能用一般的限制性内切酶消化法 1 染色体DNA大片段的制备 3 基因文库构建的一般步骤 超声波 300bp 或机械搅拌 8kb 物理切割法 内切酶Sau3A进行局部消化 可得到10 30kb的随机片断 酶切法 2 载体与基因组DNA大片段的连接 粘性末端直接连接 载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端 如 Sau3A与BamHI的酶切末端 直接连接 人工接头或同聚物加尾 人工接头法 adapter 人工合成的限制性内切酶粘性末端片断 各种酶的接头可以向公司定做或购买 接上人工接头 粘性末端 CCC CCC 末端转移酶 粘性末端 同聚物加尾 4 基因组文库的大小 一个文库要包含99 的基因组DNA时所需要的克隆数目 N ln 1 p ln 1 f p 文库包含了整个基因组DNA的概率 99 f 插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因组DNA的百分数 N 所需的重组载体数 克隆数 例如 人的基因组是3 109bp 插入DNA片断的平均长度如果是1 7 104bp N ln 1 p ln 1 f ln 1 99 ln 1 f 4 61 G f N 4 61 G f G Genome大小 f fragment大小 N 4 61 G f 4 61 3 109 1 7 104 8 1 105 1 cDNA 以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA 2 cDNAlibrary 二 cDNA文库的构建 mRNA cDNA 3 3 5 5 反转录酶 引物 利用某种生物的总mRNA合成cDNA 再将这些cDNA与载体连接 转入细菌细胞中进行保存和扩增 称cDNA文库 1 不含内含子序列 2 可以在细菌中直接表达 3 包含了所有编码蛋白质的基因 4 比DNA文库小的多 容易构建 4 构建cDNA文库的一般步骤 1 总RNA totalRNA 提取 3 cDNA文库的特点 提取总RNA有商业化的试剂盒 kit 分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱 利用mRNA都含有一段polyA尾巴 将mRNA从总RNA rRNA tRNA等 中分离纯化 mRNA只占总RNA的1 2 2 mRNA的分离纯化 原理 mRNA的分离纯化 Column 柱 反转录酶 3 cDNA的合成 cDNA第一链合成 逆转录酶能以RNA为模板合成DNA 用OligodT 或随机引物 作引物 合成cDNA的第一链 mRNA cDNA 3 5 5 AAAAAAA TTTTTTT OligodT引物 用碱处理或用RNaseH降解mRNA DNA杂交分子中的mRNA mRNA cDNA 3 3 5 5 反转录酶 引物 mRNA cDNA第一链 3 3 5 5 引物 cDNA第一链 3 5 引物 降解mRNA模板 或RNaseH 碱 剩下的cDNA单链的3 末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构 机理不明 可成为合成第二条cDNA链的引物 用DNA聚合酶合成第二链DNA cDNA第一链 5 cDNA第二链合成 DNA聚合酶 cDNA第一链 cDNA第二链 5 3 cDNA第二链合成 去掉发卡结构 核酸酶S1 用核酸酶S1可以切掉发卡结构 但这会导致cDNA中有用的序列被切掉 cDNA第一链 cDNA第二链 5 3 cDNA第一链 cDNA第二链 5 3 5 3 这种酶能识别mRNA cDNA杂交分子中的mRNA 并将其降解成许多小片断 妙用RNaseH 小片断正好成为DNA聚合酶的引物 用来合成冈崎片断 DNAPolI除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链 mRNA cDNA 3 5 反转录酶 引物 mRNA cDNA第一链 3 5 引物 mRNA cDNA第一链 3 5 mRNA mRNA DNA聚合酶 DNA聚合酶 cDNA第二链 cDNA第一链 3 5 RNaseH DNAligase 去引物 在双链cDNA末端接上人工接头 即可与载体连接 转入受体菌 或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3 端分别加上几个C或G 成为粘性末端 5 cDNA与载体连接 接上人工接头 粘性末端 CCC CCC 末端转移酶 6 cDNA文库的大小 一个cDNA文库要包含99 的mRNA时所需要的克隆数目 N ln 1 p ln 1 p 文库包含了完整mRNA的概率 99 某一种低丰度 不足14份拷贝 mRNA占细胞整个mRNA的比例 N 所需的重组载体数 克隆数 1 n 1 n 三 文库的查询 screening 用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southernblot杂交 文库 载体 探针 电泳后杂交放射自显影 测序分析 第四节目的基因的分离和扩增 一 目的基因的分离 1 探针柱分离特异mRNA 根据已知的基因序列合成探针 结合到纤维素柱上 用来分离纯化该基因的mRNA 富集特定基因的mRNA或cDNA模板 纤维柱 探针DNA 探针DNA 探针DNA 探针DNA TotalmRNA 纤维柱 探针DNA 探针DNA 探针DNA 探针DNA 过柱 与探针碱基互补的mRNA结合到柱上 其它mRNA流走 特异mRNA 洗脱 RT PCR 2 mRNA消解杂交 原理 羟基磷灰石柱 结合单链DNA RNA或DNA DNA双链 不结合单链DNA Hydroxylapatitecolumn 从表达A蛋白和不表达A蛋白的组织细胞中分别提取和分离总mRNA 将表达A蛋白的mRNA合成cDNA第一链 再同不表达A蛋白的总mRNA杂交成cDNA mRNA双链 不能杂交的cDNA就包括特异表达的A基因的cDNA单链 用羟磷灰石柱收集单链cDNA 合成为双链DNA进行扩增 克隆 测序 A A A组织 B组织 总mRNA A 总mRNA B 含蛋白A的mRNA 不含蛋白A的mRNA 总cDNA第一链 A 杂交 内含蛋白A的cDNA 羟磷灰石柱 过柱 吸收RNA DNA 单链滤过 羟磷灰石柱 B A PCR 16 cDNA文库 3 mRNA差异显示PCR DDRT PCR mRNAdifferentialdisplayRT PCR 1 3 端的锚定引物 Oligo dT 引物的3 端加两个核苷酸 倒数第二个不再是T AAAAAAAAAAAAAAAA mRNA 3 5 NM TTTTTTTT M A GorCN A G TorC 5 3 2 12种锚定引物 AG TTTTTTTT 5 3 CG TTTTTTTT 5 3 GG TTTTTTTT 5 3 TG TTTTTTTT 5 3 AA TTTTTTTT 5 3 CA TTTTTTTT 5 3 GA TTTTTTTT 5 3 TA TTTTTTTT 5 3 AC TTTTTTTT 5 3 CC TTTTTTTT 5 3 GC TTTTTTTT 5 3 TC TTTTTTTT 5 3 3 5 端的随即引物 10mer AAAAAAAAAAAAAAAA mRNA 3 5 NM TTTTTTTT 5 3 扩增cDNA第一链 RT NM TTTTTTTT 5 cDNA 3 NNNNNNNNNN 5 3 NNNNNNNNNN 5 3 cDNA第二链 并PCR 4 随机引物与锚定引物成对扩增 12种锚定引物 若与20种随机引物 可组成240组引物 引物组合 240组在能分出20000多条带 实验结果 如果每条带相当于一种mRNA 20000mRNA基本上反映了一种特定细胞中全部的mRNA 在测序胶上 每组扩出50 100条长度为100 500bp的带 5 随机 锚定引物PCR的产物电泳比较 不同组织的240组引物组合PCR产物在测序胶中电泳 选择有差异的带 进一步PCR作探针 筛选文库 找到差别基因的全长序列 二 PCR扩增获得目的基因 1 直接从基因组中扩增 1 提取基因组DNA作模板 2 根据目的基因序列设计引物 3 PCR扩增 真核生物基因组含有内含子 适合扩增原核生物基因 原核基因组部分 原核细胞 提取基因组DNA PCR扩增 1 提取基因组totalRNA 2 反转录合成总cDNA作模板 4 PCR扩增 3 根据目的基因序列设计引物 2 从mRNA中扩增 RT PCR 原核生物不易得到mRNA 也不含有polyA尾 适合扩增真核生物基因 目的基因的引物1 反转录成目的基因cDNA第一链 目的基因的引物2 目的基因cDNA第二链 PCR mRNA 克隆外源基因