分子生物学绪论第一章b.ppt

绪论Introduction 何为 分子生物学 是在分子水平上研究生命本质的一门新兴的边缘学科 是生物学研究从宏观发展到微观而形成的 终极目标是要了解所有生物学现象的分子本质 是当前生命科学中发展最快并正在与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域 分子生物学的研究对象 生物大分子 它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象 分子生物学与生物化学的关系 你中有我 我中有你 重点是大分子的结构与功能 重点是分子的代谢转化 第一章遗传的物质基础 DNA DNA一级结构DNA二级结构DNA三级结构 脱氧核糖核苷酸3 5 磷酸二酯键线状或环状 一 DNA一级结构 DNA的一级结构实际上就是DNA分子内碱基的排列顺序 DNA和RNA在稳定性上的差异 DNA的戊糖2 上没有自由羟基 很稳定 在pH11 5时DNA的一级结构几乎无变化 而RNA的戊糖有2 上的自由羟基 遇碱水解生成2 3 环式单核苷酸 极不稳定 很快转变成2 单核苷酸和3 单核苷酸 结构决定特性结构决定功能 重复序列 repetitivesequence 高度重复序列中度重复序列低度重复序列 1 高度重复序列 重复频率高 几十万到几百万次 重复序列较短 5 300bp 多数为5 15bp 有些是反向重复序列 卫星DNA 回文结构palindrome 卫星DNA satelliteDNA 在高度重复序列中 有一种由富含AT的2 10bp成串排列组成的简单重复序列 可用等密度梯度离心法将其与主体DNA分开 因此把它叫做卫星DNA 分类 微卫星DNA microsatelletiteDNA 小卫星DNA minisatelletiteDNA 重复频率重复序列长度 具有种属特异性 常作为一种分子遗传标记 2 中度重复序列 重复频率和重复序列长度差异大 有些成串集中排列 有些与单拷贝序列间隔排列 有些是编码蛋白质的结构基因 一般有种的特异性 可作为探针 区分不同种间细胞DNA 差异大 种的特异性 3 低度重复序列 序列不重复或只重复几次 十几次 重复序列长度 1000bp 携带大量能编码功能蛋白质的遗传信息 又称单拷贝序列 TheDoubleHelix 1953 Thefoundationofmolecularbiology FrancisH Crick JamesD Watson 二 DNA二级结构 1 反向平行 右手双螺旋 2 糖与磷酸通过3 5 磷酸二酯键在外侧形成骨架 3 碱基在内部 平面与螺旋轴垂直 4 A T G C 5 直径为2nm 螺距为3 4nm 10bp helix 6 大沟 majorgroove 和小沟 minorgroove TheDoubleHelix DNA二级结构的多态性 除B DNA外 人们还发现到了其它的结构参数有一定差异的DNA 如A DNA Z DNA 三链和四链DNA等 这一现象称为DNA结构的多态性 polymorphism 三链DNA A DNA 周碱基数可变DNAZ DNA 左旋DNA 双链DNA DNA三螺旋结构中的第三条链与第一条链的序列和方向均相同 这种的DNA叫R DNA 四链DNA G 四联体螺旋 含有端粒重复序列的单链寡核苷酸可以形成四联体螺旋结构 DNA结构的动态性 不同DNA结构形式相互转变的现象 称为DNA结构的动态性 DNA基本结构 B型 天然DNA分子中 以B型结构为主 在这个分子的某些区段会出现A Z型 甚至三链 四链 这些不同的结构处于动态变化中 双链DNA中配对碱基的氢键不断处于断裂和再生状态之中 特别是稳定性较低的富含A T的区段 氢键的断裂和再生更为明显 在微观上 它们常常发生瞬间的单链泡状结构 这种现象称为双螺旋的呼吸作用 DNA结构的呼吸作用 对于一些识别双链DNA开链成单链的蛋白质结合到DNA上具有重要作用 这些蛋白质需要处于呼吸状态的双链DNA来阅读和识别DNA内部所含信息 如碱基序列 碱基上可以作用的氢供体 氢受体的数目和方位等 DNA的超螺旋结构是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的构象 包括线形双链中的纽结 超螺旋 多重螺旋 分子内局部单链环和环状DNA中的超螺旋及连环等拓扑学性质 三 DNA三级结构 超螺旋结构 最常见 生物学意义1 超螺旋DNA形状更紧密 在DNA组装中有重要作用 2 超螺旋程度的改变介导了DNA结构的变化 有利于功能的发挥 3 超螺旋DNA能实现松弛态DNA所不能实现的结构转化 四 DNA的变性 复性与杂交 DNA的变性 denaturation 在物理和化学因素的影响下 维系核酸二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏 DNA双链解旋成单链 这一过程称为DNA的变性 判断 1 核酸的变性可发生在整个DNA分子中 也可发生在局部的双螺旋节段上 局部变性 2 DNA变性不涉及核苷酸中二酯键的断裂 3 引起变性的因素有酸 碱 尿素 胍等变性剂和乙醇 丙酮等化学因素以及热 紫外线等物理因素 4 变性后的DNA其一系列的物理 化学性质都发生变化 如260nm处紫外吸收值降低 粘度下降 沉降速度增加 浮力密度上升等 5 熔解曲线的中点 即一半的DNA双螺旋解为单链所对应的温度称为熔解温度或解链温度 6 每一种DNA都有一个解链温度 Tm值是一个固定常数 增色效应 同一种DNA分子在不同离子强度溶液中其Tm值不同 你还记得影响 变性的因素有哪些吗 变性的DNA重新恢复为双螺旋的过程 叫做复性或退火 DNA的复性 renaturation 分子碰撞 时间长 核心作用 时间短 拉拉链作用 限制因素 复性机制 不完全变性DNA容易迅速复性 复性DNA分子不一定是原有互补链 大部分不是原配 而是形成杂交分子 复性DNA分子的结构和理化性质等均得到恢复 复性的特点 你知道影响 复性速度的因素有哪些吗 判断 DNA片段小的比大的容易复性 盐可以减少两条互补链负电荷的排斥作用 通常增加盐浓度 可加速两条互补链重新结合的速度 DNA浓度越大 两条互补链彼此相遇的可能性越大 复性速度也越快 一定的盐浓度 适宜的温度 复性的条件有哪些 为什么 复性是分子杂交的理论基础 核酸分子杂交Nucleicacidhybridization 亲缘关系很近的不同来源的DNA单链或RNA单链与DNA单链之间通过碱基互补形成杂交分子的过程 叫做核酸分子杂交 DNA DNADNA RNA 根据核酸分子杂交的原理 有目的地人工制备或从基因组中分离一段已知序列的DNA 使其带上标记 经变性后成为单链 在一定条件下与待测DNA单链杂交 如两者序列有同源性 就形成带有标记的双链DNA分子 即检测到了待测的DNA 这段带有标记的核苷酸序列称为核酸探针或基因探针 Geneprobe 核酸探针 Nucleicacidprobe 常用的核酸分子杂交方法 Southern印迹杂交 Southernbloting Northern印迹杂交 Northernbloting 斑点杂交 dotblotting 原位杂交 insituhybridization 五 DNA序列分析及进展 DNA序列分析技术是揭开生命奥秘的一把金钥匙 吴瑞士引物 延伸测序策略 1971年首次成功地测定了 噬菌体两个粘性末端的完整序列 F Sanger 末端终止法 K Mullis PCR M Smith 碱基定点突变技术 Sanger法 1 基本原理 Sanger双脱氧末端终止法 利用脱氧核苷三磷酸 dNTP 的类似物双脱氧核苷三磷酸 ddNTP 取代正常的底物 在DNA合成反应中除了加入4种正常dNTP外 再加入1种少量的ddNTP 反应产物是一系列长短不一的核苷酸链 在4组独立的核苷酸反应中 分别加入4种不同的ddNTP 结果生成4组核苷酸链 它们分别终止于每一个A T C G的位置上 对这4组核苷酸进行聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA 可读出序列 2 反应原理 ddNTP可以在DNA聚合酶作用下和多核苷酸链的3 羟基形成磷酸二酯键 但却不能再与下一个核苷酸缩合 结果使得多核苷酸链的延伸终止 ddNTP的作用 方法过程 ddNTP与dNTP 聚丙烯酰胺凝胶电泳 DNA聚合酶单链DNA模板单链寡核苷酸引物Mg2 4种dNTP dATP dGTP dCTP和dTTP 4种ddNTP ddATP ddGTP ddCTP和ddTTP 3 反应体系 DNA序列测定策略 1 定向测序是从大片段DNA的一端开始按顺序进行分析 2 随机测序又称鸟枪策略 shotgunstrategy 是将人类基因组DNA用机械方法随机切割成2Kb左右的小片段 把这些DNA片段装入适当载体 建立亚克隆文库 从中随机挑取克隆片段 最后通过克隆片段的重叠组装确定大片段DNA序列 3 多路测序 Multiplexmethod 是鸟枪法的一种发展策略 是通过多个随机克隆同时进行电泳及阅读 快速分析DNA序列的一种技术 分析仪器 实现了凝胶电泳 初始数据获取 碱基阅读等步骤自动化 DNA自动测序仪 大规模DNA测序的趋势 自动化