环糊精修饰的嵌段共聚物微胶囊制备及缓蚀剂的填装和释放性能研究

环糊精修饰的嵌段共聚物微胶囊制备及缓蚀剂的填装和释放性能研究摘 要随着防腐技术的不断提升，缓蚀剂受到了越来越多的运用。但是缓蚀剂普遍存在着易失效、具有污染性等缺点，所以如何控制缓蚀剂的释放以及使其在关键的时刻发挥作用是需要亟待解决的问题。本次毕设以 -环糊精为核心片段，利用 ATRP 的聚合方法，合成了一种 pH 响应型嵌段共聚物。借助环糊精特有的疏水性空腔通过主-客体相互作用包裹疏水性小分子缓蚀剂苯并三氮唑（BTA），并研究其在不同 pH 值下的释放率及释放时间。研究发现目标嵌段共聚物纳米组装体具有较好的载药率和包封率，同时可以有效地控制缓蚀剂的释放，赋予缓蚀剂 pH 值响应性和良好的水溶解性，这为后期将这种微胶囊加入到涂层中提供了一定的基础。关键词：-环糊精；嵌段共聚物；苯并三氮唑；缓慢释放；pH 响应性Preparation of Cyclodextrin-Modified Copolymer Microcapsules and Study on Filling and Releasing Performance of Corrosion InhibitorsAbstractWith the continuous improvement of anti-corrosion technology, corrosion inhibitors have been used more and more. However, corrosion inhibitors generally have disadvantages such as easy to fail and pollution, so how to control the release of corrosion inhibitors and make them work at a critical moment is a problem that needs to be solved urgently. This time, I designed a pH-responsive block copolymer by using ATRP polymerization method with -cyclodextrin as the core fragment. Hydrophobic small molecule inhibitor benzotriazole (BTA) was encapsulated by a host-guest interaction via a hydrophobic cavity specific to cyclodextrin, and its release rate and release time at different pH values were studied. The study found that the target block copolymer nano-assembly has better drug loading rate and encapsulation efficiency, and can effectively control the release of the corrosion inhibitor, and impart pH response and good water solubility to the inhibitor. This is Late addition of this microcapsule to the coating provides a certain basis.Keywords：-cyclodextrin; block copolymer; hydrophobic Benzotriazole; sustained release; pH response目 录第 1 章 绪论 11.1 环糊精简介 .11.2 嵌段共聚物简介 .11.2.1 嵌段共聚物的制备方法以及环糊精聚合物的类型 11.2.2 原子转移自由基聚合方法（ATRP） .31.3 聚合物自组装及作用力 .41.3.1 环糊精聚合物与小分子及聚合物的自组装 41.3.2 非共价作用力 .61.3.2.1 主-客体相互作用（host-gust inclusion） 61.3.2.2 静电相互作用（electrostatic interaction） .61.3.2.3 -共轭效应（-effects） .71.3.3 超分子聚合物 .71.4 嵌段共聚物包裹药物在油田防腐蚀方面的应用 .71.5 研究意义及主要研究内容 .8第 2 章 嵌段共聚物 PEG-(PCD-co-PDMAEMA)的合成 92.1 前言 .92.2 原料和仪器 102.2.1 原料 .112.2.2 仪器与设备 .112.3 实验方法 112.3.1 制备大分子引发剂 PEG-Br112.3.2 -环糊精表面修饰 .112.3.3 合成嵌段共聚物 PEG-(PCD-co-PDMAEMA) .132.3.4 表征方法 .182.4 结果与讨论 142.4.1 核磁共振谱图表征 .142.4.2 利用 TEM 观察不同 pH 值下的星型聚合物以检测其 pH 响应性 .162.5 小结 17第 3 章 嵌段共聚物 PEG-(PCD-co-PDMAEMA)包裹苯并三氮唑（BTA）及在不同 pH 值下释放的研究 .183.1 前言 183.2 实验步骤 193.2.1 利用透析法包裹苯并三氮唑 .193.2.2 测量包裹药物后的纳米体系的载药量和包封率 .193.3 包裹药物后的表征方法 233.3.1 动态光散射法（DLS）测量粒径 .223.3.2 差示热扫描分析（DSC）验证包裹前后的熔点差异 .233.4 不同 pH 值下药物的释放 243.4.1 实验步骤 .243.4.2 实验结果分析 .253.5 小结 27第 4 章 总结 .28致 谢 .30参考文献 .31第 1 章 绪论1.1 环糊精简介环糊精（CD）是直链淀粉于芽孢杆菌中反应产生的一种环糊精葡萄糖基的转移酶作用产生的，它是由约 6-12 个 D-吡喃葡萄糖基通过 -1,4 糖苷键相连组成的 1。随着研究的不断进步，环糊精的产量也不断的得到提升，并且出现了越来越多的亚型，纯度也得到了很大的提高，能够达到 99%以上，在日常生活中环糊精常被用于食品加工中作为添加剂，另外在科研研究方面在药学方面应用比较广泛，现如今主要的环糊精为含有 6、7、8 个葡萄糖单元的 -,-和 -CD，这三种环糊精的内部空腔高度均为 0.79nm 而直径分别是 0.47、0.60 和0.75nm，分子直径上的不同也导致了三种环糊精在分子识别方面的区别。环糊精分子具有非常独特的棱台形立体环装结构，其外侧窄端为主羟基一端，是由C6 的伯羟基构成的，外侧阔端为次羟基一端，是由 C2 及 C3 的仲羟基组成的 2。并且环糊精的外壳是亲水性的而中间的空腔由于受 C-H 键屏蔽作用而显疏水性，所以这种特殊的性质可以使环糊精通过氢键、范德华力以及疏水性作用力识别客体小分子，并且这个识别过程中小分子通过窄端和阔端进入环糊精的疏水性空腔中会出现不同的性质和稳定性，因而环糊精也对疏水性小分子具有一定程度的识别能力。因为环糊精的独特结构所表现出的特殊性质以及环糊精廉价、合成简单等的优点，在医药学以及食品中有广泛的应用 3。同时以其无毒无害无污染的性质未来在防腐蚀方面也会有较大的前景。1.2 嵌段共聚物简介嵌段共聚物是在一个单一线性分子上存在两种或者两种以上结构不同链段的聚合物，人们可以通过不同的聚合方式来合成具有特定结构以及分子量的共聚物从而满足制备预想结构共聚物的需求。第 1 章 绪论11.2.1 嵌段共聚物的制备方法以及环糊精聚合物的类型到目前为止人们所能制备出的嵌段共聚物已经各式各样且结构新颖，比较典型的有伞型聚合物、环形共聚物、梯度聚合物（gradient copolymer）、星型聚合物（start copolymer）等等，通常情况下从分子的尺度上来看，嵌段共聚物分为两类，非线性嵌段共聚物和线性嵌段共聚物，线性嵌段共聚物通常是由两个或两个以上的单体链段在链的末端相连接形成的线型嵌段共聚物，这种类型的嵌段共聚物一般情况下形式较为单一。而非线性嵌段共聚物的种类则要比线性嵌段共聚物的种类多，形式也展现出多样化，这其中星型聚合物就是一种非常典型的非线性聚合物，它是多个线性支链通过化学键链接在同一个中心核上形成的，宏观上一般展现出球形形态，它的一个很重要的特点就是本体和溶液粘度要比相同分子量的线性聚合物低，所以可以展现出很多特殊的性质并得到了广泛的应用。目前所知道的聚合物聚合方法有很多种，包括阳离子聚合、阴离子聚合、自由基聚合、基团转移聚合（GTP）等，不同的聚合方法有不同的优点和缺点，其中活性聚合对于聚合产物的分子量、序列结构等有着优异的控制能力 4。阴离子聚合能够有效的合成具有窄分子量分布并且结构清楚地嵌段共聚物，阳离子聚合物经过不断的发展扩大了可聚合单体的种类，包括异丁烯等单体只能通过阳离子聚合进行合成。而自由基聚合法因为反应条件温和以及单体适应性广泛的特点而被大量的关注和使用，本文中所使用的也是以过渡金属离子进行氧化还原反应的原子转移自由基聚合（ATRP）。上文中讲述了多种的聚合物聚合方法，具有特殊结构的环糊精也能形成多种多样的环糊精类的聚合物（CDP），这类聚合物除了保持环糊精分子本身的对疏水性小分子的主-客体包合性之外，还同时具有了连接聚合物片段后良好的聚合物性质，并且当聚合物链上同时含有多个环糊精单元时整个聚合物还能表现出独特的协同作用，这种作用可以十分有效的提高聚合物对于客体分子的识别能力和吸附能力。随着对于环糊精的研究，研究者们发现在多种聚合物链段中引入环糊精可以带来多种意想不到的变化，尤其是在医学领域可以用于制备控制药物释放和基因治疗的材料。而 CDP 的形态也是多种多样的，主要分为线第 1 章 绪论2型结构、交联型结构、聚轮烷型结构、星型结构等，不同的结构表现出的性质会有有所不同。其中 1、交联型的 CDP 是由环糊精及其衍生物与双官能团或者多官能团的化合物或者是已有的聚合物反应得到的聚合物，研究较多的是在碱性的溶液中以环氧氯丙烷（EPH）为双功能交联剂与环糊精反应形成 EPH 交联的水凝胶，这种水凝胶体系可以包裹一些特定的药物并且具有缓蚀的作用。2、线型 CDP的结构要更为规整，其中的 CD 位置一般位于聚合物的主链上或者悬垂在聚合物的侧链，环糊精在主链上的环糊精类聚合物常被用于药物传递。而环糊精在侧链的环糊精类聚合物的合成方式分别为 1、将环糊精单体直接聚合而成。2、将功能化的环糊精偶联在含有活性官能团的线型聚合物上构成 CDP。3、星型聚合物是非线性聚合物中性质最为独特和多样的聚合物，因为利用环糊精聚合而成的星型 CDP 也具有很多奇特的性质，合成星型聚合物的方法一般分为“臂引发”（arm-first）以及 “核引发”（core-first），其中“核引发”是将 CD 改性为大分子引发剂，从而引发甲基丙烯酸酯类的单体与 CD 核聚合形成星型聚合物，而相比于“核引发”，“臂引发”聚合制备的 CDP 的臂长较为均一，但是聚合过程修饰步骤会比较繁琐。4、聚轮烷型的 CDP 则是在聚合物链有多个环糊精分子相互串联上而形成的一种超分子结构，在 1992 年首次合成之后在医学领域的应用受到了广泛的关注 5，此种结构可以构筑超分子水凝胶从而有效降低对细胞的毒性。1.2.2 原子转移自由基聚合方法（ATRP）在发现 ATRP 之前，化学家们控制大分子组成和结构的能力受到严重限制，使得难以合成出具有高度特异性，均匀特性的材料。自二十世纪五十年代中期以来，许多化学家试图开发一种“活的”或受控的自由基聚合过程，以简单，便宜的方式创造明确的聚合物。在 20 世纪 90 年代中期，全世界的几个实验室通过开发 CRP 方法克服了这个棘手的问题。这些技术允许用复杂的，明确定义的纳米级体系结构合成基本上新的材料。1995 年，卡内基梅隆大学教授Krzysztof Matyjaszewski 发现了第一种和最强大的 CRP 方法-铜介导的 ATRP6。ATRP 的发现为大分子设计提供了一条十分便利而有效的途径，其可以用于合第 1 章 绪论3成嵌段共聚物、具有末端官能团的聚合物以及利用多官能团的引发剂，大分子引发剂或者引发剂单体来合成新型的聚合物 7。原子转移自由基聚合（ATRP）是受控自由基聚合（CRP ）中最为有效和使用最广泛的方法之一，它能够允许科学家通过将单体组成的零部件以受控、逐件的方式组建在一起，从而十分轻易的得到聚合物，通过这种方法可以创造出各种具有特定位置功能的聚合物。ATRP 与早期的传统基于自由基的聚合物制造方法明显不同，它允许科学家使用一种特殊的催化剂（卤代烷RX（X=Br，Cl ）生产复杂的聚合物结构，该催化剂一次将一个或几个亚单元（单体）添加到不断增长的聚合物链中。这种活的合成过程可以随意关闭或重新启动，具体取决于反应的温度和其他条件如何变化。ATRP 是一种非常稳健的方法，可以均匀而精确地控制聚合物的化学组成和结构，以及每条聚合物链的均匀生长。目前 ATRP 已经成功的被应用于制作更好的颜料分散剂、化妆品、自清洁窗户的粘合剂和密封剂等等，另外在药物输送、心血管支架涂层、骨再生支架、可降解塑料以及光电子和汽车行业都有较大的应用前景。1.3 聚合物自组装及作用力1.3.1 环糊精聚合物与小分子及聚合物的自组装环糊精以其内部疏水外部亲水的特殊性质以及可以与客体小分子之间产生包括氢键、疏水性作用力、静电作用等在内的多种作用力而广受关注。而以环糊精为主要片段的聚合物不仅具备环糊精本身对于小分子的包合作用，还包括两亲性共聚物通过自组装对于小分子的包裹作用，因而在双重作用的影响下所能包裹的药物种类和数量更多且缓蚀效果更好更稳定。这也就是通过环糊精聚合物和客体小分子间的主-客体相互作用所驱动形成的纳米粒子 8。另外有研究人员发现 -CD 可以在不同的刺激下选择性的包裹不同的客体，例如 zhukang Du 等人利用这种性质报道了一种基于改性的 PEG 和 -CD 主客体结合的多响应性超分子量聚合物的受控自组装（如图 1-1），发现 -CD 能在不同的刺激下选择性的分别与配合物 PEG（FcC 11AzoPEG）中的二茂铁（Fc）端基、C 11 烷基链、偶氮苯（Azo ）嵌段形成不同的配合物，并且这三种配合物均能各自自组装形成纳米线、纺锤体和球形胶束，证实了 -CD 能够选择性且可控的包裹不第 1 章 绪论4同的客体小分子形成 SAP，且这些 SAP 在不同的刺激下能够形成不同的胶束聚集体，此项结论为受控自组装提供了一定的科学基础 9。图 1-1 -CD 和 PEG（FcC 11AzoPEG）的刺激反应和刺激反应后产物的形态薛方超等人利用主-客体相互作用以及环糊精及其衍生物的低毒性、低免疫性构建了客体分子介导的含有 CD 亲水性共聚物自组装的纳米药物递送系统（ADDS），用以包裹并缓慢释放大量的疏水性药物，其利用透析法制备了一种基于 PEG-P（bCD）与 PBLA 的纳米装配体（如图 1-2），这种纳米结构在正常情况下呈现近球形，且纳米颗粒的尺寸会随着 PBLA 与 PEG-P（bCD ）的重量比变化而变化,当利用聚合物 PEG-P（bCD ）通过主-客体相互作用与TPL（重组蛋白）进行自组装后发现聚合物不仅能够成功包裹 TPL，而且组装后的纳米体系能够在 pH=7.4 的 PBS 溶液中逐渐释放，证实了环糊精类聚合物在包裹小分子或是聚合物上的巨大优点 10。第 1 章 绪论5图 1-2 环糊精类聚合物包裹客体聚合物及客体小分子过程图和 PEG-P（bCD）与 PBLA 的纳米装配体的 TEM 图环糊精分子以及基于环糊精合成的聚合物以其特殊的内疏水外亲水的性质已经对于小分子的选择性识别的主-客体相互作用而受到了广泛的关注。尤其是近期对基于非共价作用力（静电相互作用（electrostatic interaction）、范德华力（Van der waals interactions）、疏水效应（Hydrophobic effects）、 共轭效应（-effects）等）所制备的超分子聚合物，它是由诺贝尔奖获得者 Lehn 最早合成的，并且是一种拥有刺激响应性的聚合物。1.3.2 非共价作用力（1）主-客体相互作用（host-gust inclusion）主-客体相互作用就是大的“主体”分子包合小的“客体”分子，也就是H(主体)+G(客体)HG(主-客体)，而这种主客体相互作用力主要包括氢键作用、静电相互作用、范德华力作用和疏水相互作用，利用这种作用力所形成的聚合物通常是具有较强的选择性识别能力以及外界刺激响应性的。Ping Shen 和 Liyan Qiu 实现了基于 -环糊精与偶氮苯之间的主-客体相互作用的超分子聚合物的双重响应周期性的自组装，所合成的具有两亲性的超分子聚合物 PAE-g-Azob-CD-PEG 同时具有 pH 响应性和光响应性，通过外界 pH 的变化以及可见光或紫外光的照射可以引起超分子聚合物的反复拆卸和重新组装，所利用的是 -环糊精与客体分子之间的选择性识别以及其易于与小分子形成稳定复合物的能力，并且所合成出的超分子聚合物 PAE-g-Azob-CD-PEG 不仅可以在水中有规则的形成球形囊泡，这种囊泡的形态还可以根据 pH 和光照来进行调节，实现超分子组装体的解离和重组装 11。第 1 章 绪论6图 1-3 环糊精类超分子聚合物聚合过程和 PAE-g-Azob-CD-PEG 的形态图（2）静电相互作用（electrostatic interaction）静电相互作用是包含斥力和引力,且静电作用力无饱和性及方向性 12。程新皓利用静电相互作用进行了两亲性分子的自组装研究，发现静电作用是一维自组装的一种十分重要的驱动力，而 - 相互作用则提供了一维的导向性，他利用静电吸引力所合成的复配体系十二烷基氯化铵/十二烷基聚氧乙烯醚硫酸钠复配体系具有能在较广范围内保持的优秀的表面性质，且具有高盐稳定性和溶剂变化稳定性，同时他将正负表面活性剂的复配体系加入保护剂后构建了一种三元复配体系并应用于油田中实现了超低的界面张力，其关键则是正负表面活性剂头基间的相互作用，展示出了静电相互作用力的优异性质 13。（3）-共轭效应（-effects）-共轭效应顾名思义就是形成 键而产生的作用力，多见于存在芳香结构的组装过程中，且共轭效应会随着 p 电子的增多而增强。-共轭效应在超分子自组装中起着十分重要的作用，其可以和多种官能团间产生多功能非共价相互作用，特别是 -，CH -， -阳离子相互作用在超分子自组装和识别中发挥着重要的作用。1.3.3 超分子聚合物 14超分子聚合物是由高分子科学和超分子科学两者交叉结合的产物 15。它的特殊之处就在于它是通过非共价键连接形成的聚合物，而正是由于非共价键的多样性和可逆性，使得超分子聚合物拥有很多特殊而又优异的性质。常见的超分子结构包括基本的线性结构以及支化的星型结构、超支化结构、侧链型结构等，不同的结构会赋予超分子聚合物不同的性质，尤其是非线性结构的超分子聚合物的性质尤为多样和独特。而超分子聚合物的一个特征性的性质就是会对外界刺激产生反应，如外界的光照、pH 值、温度、电流强度、氧气浓度等都有第 1 章 绪论7可能对超分子化合物的某些性质产生影响。而这些应激响应性往往是由于非共价键的可逆性造成的，例如热响应性就是因为当温度达到临界温度时，非共价键就会断裂导致发生性能的改变，而当温度再次升高或者降低的时候，非共价键又会再次形成并恢复到之前的性质。Jeffrey D. Hartgerink 等人合成了一种两亲性的超分子钛纳米纤维 PA，这种纤维能够可逆性的自组装成纳米纤维网络，并且可以通过 pH 值的变换形成含水凝胶，同时可以使 PA 纤维可逆的聚合从而增强其自身的稳定性，展示出其优异的性质 16。1.4 嵌段共聚物包裹药物在油田防腐蚀方面的应用当前油田中所面临的一个十分严重的问题就是采输油设备的腐蚀问题，每天世界的各大油田由于油田设备腐蚀而造成的损失更是层出不穷，而传统的防腐涂层仅仅可以解决表面的问题，持久性很差，一旦防腐涂层出现破裂就会导致涂层的效果大打折扣甚至迅速失效 17。而且传统的防腐措施还面临成本高昂，操作困难等问题，所以掺杂有包裹缓蚀剂的微胶囊的自修复涂层便应运而生，顾名思义这种涂层可以在破损后迅速而有效的达到自我修复的效果，从而大大延长涂层的寿命，避免腐蚀造成的损失，而目前所面临的一大问题时如何能够设计出一种既成本低廉无毒无害，又能有效稳定的包裹缓蚀剂药物，使其发挥出最好的效果。嵌段共聚物在医学领域用于包裹药物治疗疾病方面已经取得了较大的进展，研究人员利用其形成胶束后的高负载能力以及高稳定性来包裹药物进而进行靶向治疗 18。因而将嵌段共聚物引入到防腐蚀领域是成为了一种趋势，李艳星合成了一种三嵌段共聚物 PS-b-PDMS-b-PS，这种共聚物上的聚二甲基硅氧烷（PDMS）片段具有极低的表面能和良好的低温柔韧性和热稳定性，通过将这种共聚物加入到环氧树脂涂料中，显著的提高了涂膜对水的接触角，降低了表面能和吸水率，从而有效的提高了环氧树脂涂层的防腐蚀能力 19。而其中环糊精是研究人员常用的嵌段共聚物中的一个重要的片段，环糊精分子作为一种我们日常生活中常用于食品加工的添加剂，因为其特殊的结构而使得其拥有了许多特殊的性质，同时因为环糊精的价格较低且目前的技术已经能够将环糊精提纯到 99%以上，所以本篇文章中利用环糊精类嵌段共聚物通过主-客体相互第 1 章 绪论8作用包裹疏水性缓蚀剂苯并三氮唑，并研究其在不同 pH 值下的缓慢释放效果，进而寻找能将环糊精运用到油田腐蚀方面的可能性。1.5 研究意义及主要研究内容本文中通过 ATRP 的聚合方法合成了一种嵌段共聚物，这种嵌段共聚物的尺寸为纳米级，并且可以有效的利用其中的 -环糊精片段的疏水性空腔通过非共价作用力包裹疏水性小分子缓蚀剂苯并三氮唑（BTA），利用 DLS 和 DSC等检测方式检测发现这种方法虽然包裹率不是很高，但是可以有效的包裹 BTA并具有较好的缓慢释放效果，在 44 小时内仅仅释放了不足 12%。同时由于被嵌段共聚物包裹，所形成的载药纳米体系同时具有了共聚物片段的 pH 响应性和良好的水溶性，如此可以控制缓蚀剂根据 pH 值的变化而自动的控制释放量同时也解决了 BTA 微溶于水的问题，为后续将其填充进涂层中提供了支撑。第 2 章 嵌段共聚物 PEG-(PCD-co-PDMAEMA)的合成2.1 前言一直以来环糊精类聚合物都是医学领域的研究热点，它以其无毒无害且廉价的特质，以及特有的圆筒形疏水性和亲水性外壁结构而广受关注，这种特殊的结构使环糊精可以通过非共价作用力与疏水性小分子进行自组装形成纳米粒子，并且包裹不同的小分子可以使纳米粒子具有不同的功能。Hari Veera Thelu等人利用 -CD 和金刚烷之间的主-客体相互作用形成超分子并进而设计出了一种具有可控尺寸的新型 DNA 纳米凝胶（如图 2-1），同时证明了多价相互作用在纳米凝胶的形成和水凝胶化中起着十分重要的作用。研究发现这种 DNA 纳米粒子拥有优异的生物相容性、高效的药物包封能力和对外界刺激响应的性质，能够有效地包裹如阿霉素（DOX）之类的抗癌药物并实现体内药物递送，展示出了环糊精类聚合物优异的性质 20。第 2 章 嵌段共聚物 PEG-(PCD-co-PDMAEMA)的合成9图 2-1 DNA 链段与环糊精结合过程图王博等人利用自由基聚合制备了一种基于 NIPAAm 和 DMAEMA 的水凝胶（P（NIPAAm-co-DMAEMA）水凝胶），这种水凝胶充分利用的 DMAEMA片段的 pH 响应性，同时也展现出了对外界温度变化的响应性， DMAEMA 片段的引入同时还保持了这种水凝胶的热稳定性 21。在本章中，利用了原子转移自由基聚合法（ATRP）以溴代聚乙二醇（PEG-Br）为大分子引发剂，使聚合甲基丙烯酸酯多取代 -环糊精单体（GECD）与甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯（DMAEMA ），从而得到了外侧臂为PEG，内侧核为环糊精聚合物和 PDMAEMA 的星型聚合物 PEG-(PCD-co-PDMAEMA)，通过核磁共振谱图验证产物同时研究改变外界环境的 pH 值所引起的组装后纳米粒子的形态变化 22。2.2 原料和仪器2.2.1 仪器与设备表 2-1 主要实验仪器仪器名称 型号 生产厂家核磁共振波谱仪 AVANCE III HD 400Mhz 瑞士 Bruker 公司紫外-可见吸收光谱仪 U-3900 日立公司差示热扫描量热仪 DSC214 德国耐驰公司第 2 章 嵌段共聚物 PEG-(PCD-co-PDMAEMA)的合成11电子天平 CPA225D 赛多利斯科学仪器精密 pH 计 PHS-3C 上海精密科学仪器有限公司冷冻干燥机 BETA 1-8 LD 德国 Christ 公司超声波清洗机 KQ-700DE 型 昆山市超声仪器有限公司磁力搅拌机 HJ-6 金坛市友联仪器研究所恒温真空干燥箱 DZF-6012 上海一恒科学仪器有限公司2.2.2 原料甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA，99%）(通过碱性氧化铝柱 )，甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯（DMAEMA，99%）(通过碱性氧化铝柱)，N,N,N,N,N-五甲基二亚乙基三胺（PMDETA，99%）(直接使用),聚乙二醇单甲醚（CH 3-PEG-OH，Mw=5000 ）(直接使用 )，2-溴异丁基酰溴（BriBB，98%）(直接使用),氯化亚铜（CuBr ） (浓盐酸溶解，用水将其稀释并沉淀，乙醇和乙醚洗涤，最后真空干燥 23)，三乙胺（ TEA） (CaH2 干燥过夜，重蒸)，- 环糊精（-CD）(水中重结晶两次，真空干燥)，对甲苯磺酰氯 （TsCl ，99%）( 直接使用)，乙二胺（EDA ）( 直接使用 )，无水 N,N-二甲基甲酰胺 （DMF，99.9%）(直接使用 )，甲苯(分子筛浸泡 48 小时)，四氢呋喃（THF）(分子筛浸泡 48 小时)，乙腈(直接使用 )，乙醚(直接使用)，二氯甲烷（CH 2Cl2）( 直接使用)，丙酮(直接使用)，盐酸（HCl）(直接使用)，氢氧化钠（NaOH）(直接使用), 碳酸氢钠（NaHCH 3） (直接使用) ，氘带试剂（CDCl 3、D 2O、DMSO-d 6）(直接使用)2.3 实验方法2.3.1 制备大分子引发剂 PEG-Br将 20 gCH3-PEG-OH 溶于 100 mL 无水甲苯中，通过共沸蒸馏的方法蒸出约 40 mL 甲苯从而除去原料中残余的水分 24。待冷却到室温时，向体系中加入2.0 mLTEA 和 60 mLTHF 的混溶物，同时将整个体系放置于 16的油浴中，待体系中的温度下降到 16时，通过恒压滴液漏斗向体系中慢慢加入 1.5 mLBriBB 和 20 mLTHF 的混溶物，确保混溶物在 30 分钟内滴加完毕，利用真空脂将反应烧瓶密封后，放置于磁力搅拌器上室温下搅拌 48 小时。反应完毕后将反应溶液过滤得到滤液，滤液经旋蒸除去甲苯和四氢呋喃，得到粗产物。将第 2 章 嵌段共聚物 PEG-(PCD-co-PDMAEMA)的合成11粗产物收集后将其溶解于二氯甲烷后，将溶液移至分液漏斗中萃取。用饱和NaCl 溶液洗涤 2 次，饱和 NaHCO3 溶液洗涤 3 次 26。将有机相收集并利用无水MgSO4 干燥 12 小时，过滤掉 MgSO4 后，将滤液旋蒸浓缩除去大部分溶剂后，用过量的冷乙醚沉淀 4 小时，可见明显的白色沉淀出现，抽滤后真空干燥便可得到产物。2.3.2 -环糊精表面修饰通过多取代的方法利用甲基丙烯酸酯对环糊精进行修饰得到单-甲基丙烯酸酯及多-甲基丙烯酸酯取代 -CD 的混合物，具体方法如下：（1）合成单-6-对甲苯磺酰-环糊精（6-Ts-CD）将 36 g-CD 加入到 300 mL 去离子水中，并将体系放置于磁力搅拌器上不断搅拌，会发现环糊精混悬于水溶液中无法完全溶解。通过恒压漏斗向体系中慢慢滴加含有 3.94 gNaOH 的 12mL 水溶液，随着 NaOH 的加入不停地搅拌体系溶液，一段时间后溶液变澄澈，此时测量体系中的 pH 值为 13 左右，环糊精完全溶解。滴加完毕后，将反应体系置于冰水浴中静置 30 分钟，此期间不断向冰水浴中补充冰块，保证体系温度保持在 05 25。之后称取 9.08 gTs-Cl 溶于27 mL 乙腈中，用玻璃棒搅拌使其充分溶解后，使用恒压滴液漏斗将溶有 Ts-Cl的乙腈溶解缓慢加入到上述反应体系中，并保证所滴加的溶液在 2 个小时之内滴加完毕，滴加期间同时保证反应体系温度在 05，随着溶液的不断加入会发现反应体系中有沉淀出现并且溶液上层会出现泡沫，这是环糊精反应的正常现象。滴加完毕后将体系密封并继续反应 3 小时后，离心收集沉淀并置于真空干燥器中干燥，测量上层清液的 pH 值为 11 左右，证明 -环糊精与 Ts-Cl 发生了反应，之后将上层清液用稀盐酸调节至 6 左右，放置在冰箱中过夜，冰箱温度保持在4，放置一段时间后会发现溶液中有沉淀不断析出，12 小时后将体系离心收集沉淀并真空干燥完毕后，将两次沉淀混合后用去离子水重结晶两次，真空干燥得到白色粉末即为产物 6-Ts-CD。第 2 章 嵌段共聚物 PEG-(PCD-co-PDMAEMA)的合成13（2）合成 6-脱氧基-2-氨基乙基氨基 -环糊精（6-EDA-CD）用电子天平称取 3.6 g 6-Ts-CD 加入到圆底烧瓶中，同时加入 60 mL 乙二胺，将体系在通氮气的环境下搅拌 15 分钟，使 6-Ts-CD 充分溶解。溶解完毕后将体系置于 80的油浴中加热搅拌反应 6 小时，移至真空旋蒸机内旋蒸浓缩除去大部分没有反应的 EDA。旋蒸完毕后待产物冷却一段时间，将其逐滴加入到不断搅拌的过量丙酮中沉淀并过滤 26。收集沉淀用去离子水溶解后用相同的步骤再次用丙酮沉淀并过滤，收集沉淀真空干燥得到白色粉末即为产物 6-EDA-CD。（3）合成甲基丙烯酸酯取代的 -环糊精单体（GECD）用电子天平称取 2 g6-EDA-CD 溶解到 20 mL 无水 DMF 中，同时向体系中加入过量 GMA，反应体系在通氮气的条件下搅拌 30 分钟，之后将体系移入60油浴中反应 6 小时。反应完毕后将体系中的液体通过恒压滴液漏斗逐滴向不断搅拌下的大量丙酮中滴加，滴加完毕后将溶液静置 10 分钟后过滤，过滤后的沉淀经无水 DMF 溶解后重复上述操作，真空干燥得到的白色粉末就是产物GECD。2.3.3 合成嵌段共聚物 PEG-(PCD-co-PDMAEMA)取 0.005 gCuBr 和 20.9 LPMDETA 溶解于 0.5 mL 无水 DMF 中，按照液氮冷冻-抽真空-充氮气解冻融化步骤循环三次，完成后，称量 0.275 g 大分子引发剂 PEG-Br，1.32 gGECD 以及 0.421 mLDMAEMA 溶于 3.5 mL 无水 DMF，加入到上述体系中，混合完毕后将体系再按照液氮冷冻-抽真空-充氮气解冻融化步骤循环三次。操作完毕后将体系置于 80油浴中搅拌反应 48 小时，结束后将反应后的溶液转移到透析袋（MWCO=7000Da）中，用去离子水透析 48 小时，再转移到冷冻干燥机中冷冻干燥可以得到产物。2.3.4 表征方法（1）核磁共振谱分析（ 1H NMR）以 CDCl3 作为 PEG-Br 的溶剂，以 D2O 作为 GECD 和 6-EDA-CD 的溶剂，以 DMSO-d6 作为 PEG-(PCD-co-PDMAEMA)和 6-Ts-CD 的溶剂，进行核磁谱图的测定。核磁共振谱是显示聚合物结构十分有效的一种测试途径，通过图谱中峰位置、峰面积以及峰强度可以分析出所测聚合物的聚合度、特征片段等信息第 2 章 嵌段共聚物 PEG-(PCD-co-PDMAEMA)的合成13进而可以证明反应是否成功。在本实验中利用核磁共振谱检测了引发剂 PEG-Br、GECD 以及最终的嵌段共聚物的合成情况，通过分析其中的特征峰辅助证实了产物的结构。（2）动态光散射分析（DLS）利用 DLS 测定所合成聚合物的粒径以及粒径分布， DLS 可以有效的反应出所合成物质尤其是纳米级的物质的粒径及颗粒均匀度情况，通常可以作为 TEM的一个辅助检测工具，可以比较简易且迅速的反映出粒径的大小，从而初步判断所合成物质是否准确，均匀度如何。本次使用利用 DLS 分别测量了包裹前后的嵌段共聚物和载药纳米体系的粒径情况并进行了对比，展现了载药前后的粒径差异。（3）透射电子显微镜（TEM）利用 TEM 观察聚合物的形态。TEM 作为观察纳米级结构最好的检测方法，可以直观的观察出所合成物质的形态、粒径大小以及分布均匀度情况。本文中通过 TEM 测量出了嵌段共聚物在不同 pH 值下的形态和粒径，验证了共聚物的pH 响应性。2.4 结果与讨论2.4.1 核磁共振谱图表征（1）利用 1H NMR 表征 PEG-Br本次所合成的 PEG-Br 作为“臂引发”（arm-first method）的大分子引发剂，作用是引发甲基丙烯酸酯类单体的聚合从而形成以 PEG-Br 为臂的一种星型聚合物，上图 2-2 为引发剂 PEG-Br 的核磁分析图谱，可以看出 =3.38 ppm 是 PEG末端的甲基质子峰 a（-OCH 3），=1.94 ppm 是酰溴上的 b（-C (CH 3)2Br）,CH 3)峰，=3.45-3.80 ppm 是 PEG 片段上的 c（-CH 2-）的峰，通过图谱可以证明 PEG-Br合成成功。第 2 章 嵌段共聚物 PEG-(PCD-co-PDMAEMA)的合成16图 2-2 PEG-Br 的 1H NMR 分析图谱（2）利用 1H NMR 表征 GECDGECD 是单甲基丙烯酸酯取代和多单甲基丙烯酸酯取代 -CD 的混合物，其既可以作为单体存在又可以作为星型聚合物 PEG-(PCD-co-PDMAEMA)的交联剂，从他的核磁共振图 2-3 中可以看出 =6.07 和 5.65 ppm 处的峰为 GMA 上的双键质子峰 b，b（CH 2），=4.97 ppm 是位于 -环糊精上的质子峰（C1-H）。caba cc cddbbbbb,b）a,a）a,a第 2 章 嵌段共聚物 PEG-(PCD-co-PDMAEMA)的合成15图 2-3 GECD 的 1H NMR 分析图谱（3）利用 1H NMR 表征 PEG-(PCD-co-PDMAEMA)图 2-4 PEG-(PCD-co-PDMAEMA)的 1H NMR 分析图谱通过 ATRP 的方法以 PEG-Br 为引发剂，同时聚合 GECD 和 DMAEMA 可以得到内部以 DMEAMA 和 GECD 为核，外侧以 PEG 为臂的嵌段共聚物聚合物PEG-(PCD-co-PDMAEMA)。从如上图 2-4 的 1H NMR 图谱可以看出 =2.20 ppm和 4.00 ppm 分别为 PDMAEMA 链段上的叔氨基甲基质子峰（N(CH 3)2）和与羟基相连的亚甲基质子峰（COCH 2），=4.84 ppm 是 -CD 糖单元一位 C 上的质子峰（C1-H），=3.36-3.49 ppm 为 PEG 片段上的亚甲基质子峰。 =3.50-3.80 ppm 为 -CD 上的质子峰（ C3-H，C5-H）。=2.44 ppm 处的峰是溶剂 DMSO-d6。第 2 章 嵌段共聚物 PEG-(PCD-co-PDMAEMA)的合成162.4.2 利用 TEM 观察不同 pH 值下的星型聚合物以检测其 pH 响应性在上述合成的星型聚合物中的 PDMAEMA 片段是一种有 pH 响应性的聚合物，它的 pKa 值为 7.1。也就是说当所处环境的 pH 值小于 7.1 的时候，聚合物PDMAEMA 上的叔氨基团会发生质子化，从而形成了亲水性的阳离子聚合物，当所处环境的 pH 值大于 7.1 时，聚合物 PDMAEMA 就会发生去质子化成为疏水性的聚合物。所以利用 TEM 观察所合成的星型聚合物分别在pH=3.0、pH=7.0 和 pH=10.0 的水溶液中的性质和形态的变化，所得到的结果如下图 2-4 所示，可以发现星型聚合物在三种 pH 值的水溶液中的粒径均在 30 nm左右，相差很小，这可能是因为所合成的共聚物形态为星型，聚合物中的 PCD 片段和具有 pH 值响应性的 DMAEMA 片段交联嵌合在聚合物的交联核中，从而导致了外界环境的 pH 值变化对聚合物的尺寸影响不明显。图 2-5 共聚物在 pH=3.0(a)、7.0(b)和 10.0(c)环境下的 TEM 图从图 2-5 中可以得到当溶液的 pH 为 10.0 和 pH 为 3.0 时聚合物均发生了不同程度的聚集，这可能是因为在改变外界环境 pH 值时速度过快，导致环境 pH突然发生变化，从而引发了聚合物的聚集。2.5 小结在本章中我利用了 ATRP 法合成了一种嵌段共聚物，这种两嵌段聚合物在水溶液中呈现出球形的纳米颗粒，聚合物上的三个片段分别作用为：1、PEG 用于提高聚合物的水溶性，可以让聚合物有效的溶解到水溶液中。2、PDMAEMA 片段拥有 pH 响应性，所以理论上当星型聚合物分别处于pH=3.0、7.0、10.0 时粒径会呈现逐渐减小的趋势，但是实际的 TEM 测试中发现三种 pH 值下的所展现出的粒径基本没有变化，这是由于星型聚合物的特殊第 2 章 嵌段共聚物 PEG-(PCD-co-PDMAEMA)的合成17结构导致了 PDMAEMA 片段和 PCD 片段互相交联在核内，弱化了 PDMAEMA片段对外界环境 pH 值的响应性，但是当聚合物在包裹了客体分子之后对于外界 pH 值的变化的响应性会显著增强，这里具体的原因会在下一章节进行解释。3、PCD 片段是利用 -CD 合成的环糊精单体 GECD，其除了是聚合物的一个片段之外还是整个星型聚合物的交联剂，它可以驱使形成星型聚合物的交联核，并且作为包裹客体小分子的主要片段，PCD 片段拥有着至关重要的作用。在本章中我成功合成了两嵌段星型聚合物 PEG-(PCD-co-PDMAEMA)，但是仍然存在着所合成出的聚合物粒径分布不均匀，溶解于不同 pH 值的溶液中易发生聚集，产物产量偏低的问题，还需要进一步的探索更加完善的制备方法。第 3章 嵌段共聚物 PEG-(PCD-co-PDMAEMA)包裹苯并三氮唑（BTA ）及在不同 pH 值下释放的研究第 3 章 嵌段聚合物 PEG-(PCD-co-PDMAEMA)包裹苯并三氮唑（BTA）及在不同 pH 值下的释放研究183.1 前言嵌段共聚物以其较低的成本，高效稳定的药物包裹性而被广泛研究，而环糊精类的共聚物之前多被研究人员应用于药物的包裹和递送上。例如癌症的治疗药物阿霉素等，这类药物在经过共聚物的包裹之后不仅可以有效避免药物本身的毒性带给正常细胞的伤害，还可以达到靶向递送、靶向消除的效果 27。经过长时间的研究环糊精类嵌段共聚物在包裹人体疾病的治疗药物方面已经有了很大的发展，而将环糊精类的嵌段共聚物目前应用于防腐蚀领域还是很少的，所以我认为可以将这类共聚物的高稳定性，高包裹率，低成本等优点应用于防腐蚀领域，利用环糊精类共聚物通过主-客体相互作用包裹疏水性的缓蚀剂小分子形成微胶囊，后续将其掺入到防腐涂层中达到缓慢释放和自修复的效果。而苯并三氮唑（BTA）是在防腐领域十分常见的铜缓蚀剂，它不仅是一种阳极型缓蚀剂，而且自身是一种微溶于水的纳米尺寸的结晶 28。它的用途很广泛，主要是用于铜和铜合金的缓蚀剂及金属防锈剂，另外在涂料添加剂、合成洗涤剂、气相缓蚀剂和紫外吸收剂方面也有多种用处 29。但是苯并三氮唑自身是有毒性的，其不仅对生物体有害而且会污染环境，所以如何稳定的包裹苯并三氮唑并使其在涂层中缓慢而稳定的释放是需要解决的关键问题。缓慢释放问题一直都是近些年来研究人员研究的热点，尤其是如何使具有特定效应的药物不仅拥有缓慢释放效果还要具有靶向和定时准时释放的效果。而利用具有对外界环境刺激有响应性的嵌段共聚物包裹药物，并控制其随着外界特定条件变化而控制释放量的多少和释放速率的快慢是目前研究比较热门的领域，一般的，嵌段共聚物因为具有某些特定的片段而会对如外界环境的 pH值大小、氧气浓度、CO 2 浓度以及温度等具有刺激响应性，比如 DMAEMA 就具有典型的 pH 响应性。吕世贤等人在研究能够提高药物负载量的作用力时，以 4-(羟甲基)苯基硼酸频哪醇碳基咪唑修饰 mPEG-b-PHEA 而合成了一种两亲性共聚物 P-PBA，经过试验证明发现这种共聚物对外界环境的 pH 变化具有敏感性，酸性可以加速药物的释放（图 3-1）。当然并不是所有的刺激性效应都能对药物的包裹和释放产生正向效应 30。第 3 章 嵌段聚合物 PEG-(PCD-co-PDMAEMA)包裹苯并三氮唑（BTA）及在不同 pH 值下的释放研究19图 3-1 mPEG-b-PHEA 化学式和不同聚合物的包裹率和包裹效率图表张建新等人通过多步大分子取代制备了嵌段共聚物 PEG-b-PCDs，这是一种两亲性的共聚物纳米组装体，其形态为球形，且通过实验证明这种两亲性的双嵌段共聚物虽然能够有效稳定的装载药物，但是会被竞争性化合物刺激而加速药物的释放，从而大大影响共聚物的作用 31。所以综合来看，摸透所合成的共聚物的正向外界刺激响应性和负向刺激响应性，并做到充分利用优点以及规避缺点是至关重要的。本章中我主要是就将包裹药物之后的纳米体系装入透析袋（MWCO 7000Da）中，分别放入 pH=5.0 的 ABS 和 pH=7.4 的 PBS 中 32，依照设定的时间间隔进行取点并测量所取出液体在 260 nm 位置的吸光度，进而计算出所取液体中的药物（BTA）的浓度，得到不同时刻药物的释放量从而得到释放曲线。3.2 实验步骤3.2.1 利用透析法包裹苯并三氮唑将 PEG-(PCD-co-PDMAEMA)与 BTA 按照 2:1 的比例混合，将其溶解于DMSO 中使得最终 PEG-(PCD-co-PDMAEMA)的浓度为 10 mg/mL，充分溶解后在 50的油浴中连续搅拌过夜。反应结束后将反应后的溶液移入到透析袋中，将透析袋置于去离子水中在室温下透析 12 小时，之后移入冷冻干燥机干燥得到产物 33。3.2.2 测量包裹药物后的纳米体系的载药量和包封率（1）测量不同浓度的 BTA 在不同溶液中的紫外标准曲线测量 4-6 个不同浓度下的 BTA 在 260 nm 位置的吸光度并绘制紫外标准曲线。首先将 BTA 溶解于 DMSO 中配成浓度范围为 0.001-0.02 mg/mL 的溶液，再第 3 章 嵌段聚合物 PEG-(PCD-co-PDMAEMA)包裹苯并三氮唑（BTA）及在不同 pH 值下的释放研究20用紫外-可见分光光度计测量特征点 260 nm 处的吸光度，进而绘制出吸光度与浓度的标准曲线（图 3-2、3-3、3-4）。0. 0.50.1 0.150.2.0.20.40.60.81.01.2 Abs浓 度 /mg/LEquationy = a+ b*xWeight No WeightingRsidual Sum of Sqres0.129Pearsons r 0.916Adj. R-Square.7ValueStandr EroB Intercpt -0.2650.123Slo 53.947.95Y=53.29472X-0.265图 3-2 BTA 在水溶液中的紫外标准曲线标准曲线公式：Y=53.29472X-0.02665 R=0.997910. 0.20.40.60.80.1.0.50.10.150.20.250.30.350.4 Abs浓 度 (mg/L)Equationy =a +b*xWeight No WeightingRsidual Sum of Sqres3.952E-5Pearson r 0.973Adj. R-Square .19ValueStandr ErorL Intercpt -0.6080.36Slo 35.7952.58Y=35.792X-0.608图 3-3 BTA 在 PBS 溶液中的紫外标准曲线标准曲线公式：Y=35.79592X-0.00608 R=0.99919第 3 章 嵌段聚合物 PEG-(PCD-co-PDMAEMA)包裹苯并三氮唑（BTA）及在不同 pH 值下的释放研究210.00.20.40.60.80.10.0.50.10.150.20.250.30.350.4 Abs浓 度 (mg/L)Equationy = a+ b*xWeight No WeightingRsidual Sum of Sqres 4.6734E-6Pearsons r 0.97Adj. R-Square .9ValueStandr ErorB Intercpt -0.130.124Slo 37.987 .83Y=37.91837X-0.13图 3-4 BTA 在 ABS 溶液中的紫外标准曲线标准曲线公式：Y=37.91837X-0.00113 R=0.9999这三条所测得的直线中，BTA 在水溶液中的标准曲线主要用于测量包裹BTA 后的纳米体系的载药量和包封率，在 PBS 溶液和 ABS 溶液中的 BTA 标准曲线则是用于测量包裹 BTA 后的纳米体系在不同 pH 值下的释放速率，进而验证其是否有 pH 响应性以及缓慢释放性。（2）计算包裹药物后纳米体系的载药量和包裹率取出一部分包裹药物后的冻干粉利用精密天平称量 5 mg 并溶入到 10 mLDMSO 中，配制成 0.5 mg/mL 的原始溶液，待其充分溶解后，从原始溶液中取出一部分溶液进行稀释，分别配制成四个不同浓度的待测溶液，且溶液浓度要尽量保持在 0.001-0.02 mg/mL 之间。配制完成后利用紫外-可见分光光度计测量这四个不同浓度溶液在 260 nm 处的吸光度，并根据上图所测的标准曲线可以得到纳米体系的药物浓度，进而通过公式便可求出载药量和包封率。载药量（% ）=100% （3.1）包封率（% ）= 100% （3.2）最终经过计算得出载药量为 4.37%，包封率为 13.11%，证实 BTA 被嵌段共聚物所成功包裹，而且上述进行的透析法中并没有进行良溶剂与劣溶剂混合第 3 章 嵌段聚合物 PEG-(PCD-co-PDMAEMA)包裹苯并三氮唑（BTA）及在不同 pH 值下的释放研究22从而促使嵌段共聚物自身自组装包裹药物，而是单纯的利用 -环糊精的疏水性空腔与疏水性客体小分子 BTA 利用主-客体相互作用进而包裹。所以最终的包裹率相对较低。3.3 包裹药物后的表征方法3.3.1 动态光散射法（DLS）测量粒径利用动态光散射法分别测量包裹药物前的嵌段共聚物和包裹药物后的纳米体系的粒径，通过对比可以基本判断是否包裹成功。10 20 30 40 500510152025303540 Intesity中%Hydroynamic DiametrnmPEG-(PCD-co-PDMAE) BTA-Ns图 3-5 PEG-(PCD-co-PDMAEMA)与 BTA-NPs 的 DLS 对比图从图 3-5 中可以看出未包裹药物的聚合物 PEG-(PCD-co-PDMAEMA)粒径在 150 nm 左右，粒