发育毒理学PPT课件

1,发育毒性与致畸作用 （Developmental Toxicity and Teratogenesis）,2,【内容】,发育毒性与致畸作用基本概念 发育毒性终点与发育各阶段发育毒性作用的特点 母体毒性与发育毒性关系与剂量-反应模式 致畸作用机制 发育毒性和致畸作用评价方法：动物发育毒性试验、流行病学研究、替代试验,3,第一节 概 述,4,Dying to separate,拉丹和拉蕾是伊朗一对连体姐妹，出生时头颅后部相连，面部、五官和躯干肢体都互不相连。她们共同生活了29年，都希望能相互分开独立生活。为追求自己的梦想，她们曾向德国医生求助，但医生认为风险过高，拒绝为她们操刀。,5,2002年姐妹俩慕名前来新加坡，希望成功为头部相连的尼泊尔连体婴分体的神经外科医生吴有晶，能帮助她们实现分体。医生多次劝阻，但姐妹俩坚持要分体。她们认为连体的生活“比死亡还要糟糕”。对于分离手术带来的死亡威胁，两姐妹表示，在苦苦等待29后，已经不在乎“这点威胁”了。 医院先确认可以对她们进行分体手术，尔后又研究解决了医学道德、法律和手术后护理等许多问题。2003年6月，医院宣布将对她们进行分颅手术。伊朗总统哈塔米宣布，伊朗政府将承担此次高达约30万美元的医疗费用。,6,这对连头姐妹头部在X光拍片,7,这例颅脑分离手术是历史上第一例成年头部联体分离手术。引起医学界高度关注，来自新加坡、美国、法国、日本、瑞士和尼泊尔共24名专家以及100多位助手参加了手术。最复杂之处在于，姐妹俩虽各有一个大脑，但共用一条向脑部供血的主动脉。 2003年7月8日开始手术。50多个小时的马拉松式的手术终于使姐妹们实现生前最大的愿望分开来，拥有独自个体，不过这个愿望只实现了九十分钟就先后死亡。致命原因是未能阻止脑部大量出血。 7月12日，连体姐妹被分别装在两个棺材中埋葬。超过两万人参加了葬礼。全国“为她们两人的勇气、承担与众不同命运的毅力，以及她们追求更快乐未来的意志致敬”。,8,生殖发育是哺乳动物繁衍种族的正常生理过程，其中包括生殖细胞(精子/卵细胞)发生、卵细胞受精、着床(imbed，或植入implantation)、胚胎形成、胚胎发育、器官发生(organogenesis)、分娩和哺乳过程。也可称为繁殖过程(reproduction)。,人类社会之所以存在最基本的生理过程！,9,外源化学物或其它环境因素与机体接触后，可干扰生殖发育任何环节，并造成损害作用。,化学因素,物理因素,生物因素,环境,10,近年来随着毒理学和生命科学的深入发展，外源化学物对生殖发育损害作用的研究又进一步分为两方面：对生殖过程的影响，即生殖毒性(reproductive toxicity)对发育过程的影响，即发育毒性(developmental toxicity) 两方面都逐渐发展成为毒理学的分支科学；前者称为生殖毒理学(reproductive toxicology)，后者称为发育毒理学(developmental toxicology）。 生殖毒理学主要涉及外源化学物对性成熟后哺乳动物生殖功能的影响，评定方法即为生殖毒性试验。,11,发育毒理学*（developmental toxicology）研究发育生物体在受精卵、妊娠期、出生后、直至性成熟的发育过程中，由于出生前接触导致异常发育的理化因素或环境条件后的发病机制和结果 是毒理学的重要分支学科,12,发育毒理学是在畸胎学基础上发展起来的毒理学分支学科,畸胎学(古代),现代实验畸胎学(19世纪),发育毒理学,13,畸胎学,神话人物如独眼巨人、海妖等的原型可能来自严重畸形的婴儿,独眼巨人,14,Hybrid theory (杂交理论)认为畸形是人和动物杂交的结果 并且这种杂交动物广泛存在于神话传说中，如人头马身怪物、人身牛头等,15,16,“teratology （畸形学）”来自于希腊语“monster（怪胎）”，即“teras（畸胎）” 1651年，William Harvey提出发育障碍学说：畸形起因于器官或结构的不完全发育,17,现代实验畸胎学,鸡蛋,畸形小鸡,19世纪,神经管缺陷、无脑畸形、脊柱裂、独眼畸形、心脏缺陷、位置颠倒、联体双胞胎等,物理(震动、倒置，针刺),化学因素,18,对人类具有致畸作用的因素,动物实验表明，具有致畸作用的化学物有2500多种(1995年Shepard) 肯定的人类致畸因素仅数十种，其中化学物或药物40多种,19,电离辐射(放射治疗、放射性碘等) 化学物和药物：镇静安眠药，抗惊厥药，抗抑郁药，致幻药和毒品，抗癌药，维生素A类似物等 吸烟 病毒感染等 母体代谢失调(克汀病、糖尿病、高烧、苯丙酮尿症、酒精中毒等),20,21,Heavy alcohol consumption can decrease brain size. This top picture is a view of two human brains. One is a normal infant brain at 6 weeks. The one on the right is a view of an infant with fetal alcohol syndrome. You can see that the fetal alcohol brain is smaller and looks irregular. The folds in the brain tissue are different than the normal brain.,22,反应停(thalidomide)事件*,孕妇的理想选择？ 1953年，联邦德国一家名为Chemie Gruenenthal的制药公司研究发现，反应停具有一定的镇静安眠作用，而且对孕妇怀孕早期的妊娠呕吐疗效极佳1957年10月1日该公司将反应停正式推向市场,23,反应停便成了“孕妇的理想选择”（当时的广告用语），在欧洲、亚洲、非洲、澳洲和南美洲被医生大量处方给孕妇以治疗妊娠呕吐,科学家们在研制反应停时，并没有料到这种药物会产生如此可怕的副作用,24,到了1961年，欧洲的医生们开始发现，本地区畸形婴儿的出生率明显上升。这些婴儿有的是四肢畸形(主要是双上肢的短肢畸形)，有的是腭裂，有的是盲儿或聋儿，还有的是内脏畸形,令人恐怖的副作用,25,26,调查显示，孕妇怀孕时末次月经后第34 50天是反应停作用的敏感期，口服200mg便可引起严重的短肢畸形；还可能引起流产、早产和死胎。 在此时间段以外服用反应停，一般不会导致胎儿的出生缺陷 动物模型复制成功,27,支付巨额赔偿金,1970年4月10日，案件的控辩双方于法庭外达成了和解，Chemie Gruenenthal公司同意向控方支付总额1.1亿德国马克的赔偿金 反应停事件是人类历史上的一个悲剧，也是一个转折。它促进了化学致畸的研究以及管理法规的建立。,28,人类不良生殖结局,生殖发育是哺乳动物繁衍的生理过程，其中包括生殖细胞（配子，即精子和卵细胞）发生、卵细胞受精、着床、胚胎形成、胚胎发育、器官发生、胎仔发育、分娩和哺乳过程。 正常生育率?,50着床后的丢失（流产和死胎） 31严重畸形 2-3较小的出生缺陷 14神经功能异常 16-17低出生体重 7,29,What are Birth Defects!,Birth Defects (BD) are physiological or structural abnormalities that develops at or before birth and is present at the time of birth, especially as a result of faulty development, infection, heredity, or injury. Also called congenital anomaly.,30,31,BDs in China,In China, the rate for BDs is also 5% 800,000-1,200,000 per year/1.9 per minute In some region (Shanxi), this rate can over 10% For congenital heart disease, the cost of treatment 12,000 M/year,32,国家“十一五”中长期发展纲要 国务院重点领域及其优先主题（人口与健康）第一条： 安全避孕节育与出生缺陷防治 国务院重大科学研究计划：蛋白质/量子调控/纳米/发育与生殖/干细胞 国家基础研究重大项目等 国家确定山西省平遥、和顺、中阳、平定4县为全国人口出生缺陷干预工程试点县 国家确定9月12日为“中国预防出生缺陷日”。,Related to our lives! Dangerous!,33,畸形与发育毒性,外来化学物可干扰胚胎以及胎儿的发育过程，影响正常发育。具体表现可分为*：1生长迟缓(growth retardation) 。2致畸作用(teratogenicity) 。3功能不全或异常。4胚胎或胎仔致死作用(embryolethality) 。 致畸作用是外来化学物发育毒性的一种具体表现，对存活后代机体影响较为严重，往往是一种不可逆过程。有些文献中将致畸作用称为发育毒性，可以理解为发育毒性的狭义概念。,34,第二节 发育毒性与致畸性,35,一、基本概念,畸形*(malformation) ：指出生前因素引起发育生物体的严重的解剖学上形态结构的缺陷(异常) 对发育、生长、生理功能、生育力和（或）寿命可产生有害影响 可以存活也可能不能存活,36,致畸性（teratogenicity）和致畸作用(teratogenic effect)：均指在妊娠期（出生前）接触外源性理化因素引起后代结构畸形的特性或作用 致畸作用所表现的形态结构异常，在出生后立即可被发现,?,37,致畸物*(teratogen)：凡在一定剂量下，能通过母体对胚胎或胎儿正常发育过程造成干扰，使子代出生后具有畸形的化学物称为致畸物或致畸原 畸胎：具有畸形的胚胎或胎仔,38,受精卵中含有构建个体的全部信息，发育涉及储存在DNA内遗传信息的逐步表达，由此产生各种细胞、组织的分化，各具不同的代谢、形态结构和功能。这一过程由许多不同的调节机制控制，同时也受环境因素以及邻近组织诱导作用的影响。这一过程都是很严格地进行的，若其中一个环节受到干扰，均可导致畸形。,畸形发生的原因,Epigenetics?,39,不发育(agenesis) 某个器官或躯体部分发生或完全缺如。 发育不全(hypoplasia) 这种畸形常在名词前冠以“小”字，如小头、小眼等。此外，亦有软骨发育不全等。 发育受阻 某器官或结构发育至半途时受阻而停止，可分为四类：不合并(non-fusion）；不分裂(non-division），如动脉干永存；抑制迁移(sup-pressed migration）；暂时性结构的保存(persistence of transitory structure），如肛门闭锁、憩室等。 相邻原基粘连 如马蹄肾，或原基分裂，如分裂输尿管。 生长过度（overgrowth） 如多指、巨指或先天性角化过度等。 错位（misplacement） 如内脏错位等。 错误迁移（incorrect migration） 如卵巢迁移到外生殖器，并耳等。 不典型分化(atypical differentiation） 包括先天性肿瘤的形成、异位和分化。 返祖（atavism） 常见的有多毛、复乳等。,40,一头二身四腿,连体婴儿,头部连体,双头畸形,美人鱼综合症,三腿,41,42,43,致畸作用的影响因素,孕妇对致畸因子的感受性，在个体之间存在着差异。 胎儿发育的不同阶段，对致畸因子的感受性不同，大多数致畸因子有其特定的作用阶段。 致畸因子的作用机制有所不同。许多药物和病毒对某种组织、器官有特别亲和性，故特别易侵及某种组织和器官影响其发育。 致畸因子的损伤与剂量有关，通常剂量越大，毒性越大。 致畸因子的作用后果，包括胎儿死亡、生长发育延迟、畸形或功能缺陷。究竟出现何种后果，则取决于致畸因子，母体及胎儿胎盘的相互作用如何。,44,变异(variation)：指同一种属的子代与亲代之间或者子代的个体之间，有时出现不完全相同的现象，是小的或次要的结构改变,变异是生命的一种特征，在生物学上具有适应与进化的意义，变异并非畸形，但有时与畸形难于严格区分。 例如肋骨或椎骨数目多于或少于正常，甚至某些内脏易位也属於变异,45,一般认为变异不影响正常生理功能，更不危及生命 但是在动物致畸试验中，如果某种变异出现较多，并呈现一定剂量-效应关系，应该引起注意,46,胚胎-胎儿毒性,胚胎毒性*(embryotoxicity)：通常是指外源性理化因素造成的孕体着床前后直到器官形成期结束的所有的毒性。 表现为：胚胎期染毒而出现畸胎、生长迟缓、着床数减少和吸收胎，也偶有晚死胎,47,胎儿毒性(fetotoxicity) ：指器官形成期结束后的因素引发的任何毒性表现。 包括死亡、体重降低、骨化迟缓、功能缺陷以及结构异常，甚至肿瘤 在实验动物发育毒性试验中，通常不去区分胎儿与胚胎，所以使用胚胎-胎儿毒性更恰当,48,发育毒性(developmental toxicity) *：指出生前经父体和/或母体接触外源性理化因素引起的在子代到达成体之前内出现的有害作用。包括结构畸形生长迟缓功能障碍死亡,49,发育毒物（developmental toxicant）:能造成发育毒性的物质 发育毒物应是在未诱发母体毒性的剂量下产生发育毒性的物质,50,出生缺陷 （birth defect）：是指婴儿出生前即已形成的发育障碍。 包括： 形态结构异常：畸形 功能缺陷：如智力低下，代谢和行为的异常,51,受精卵 器官形成 出生 成年,胚胎毒性 胎儿毒性,畸形 变异 出生缺陷,发育毒性,发育毒性：结构畸形、生长迟缓、功能障碍及死亡 出生缺陷：畸形和功能缺陷畸形：形态结构 胚胎毒性：器官形成期 胎儿毒性：器官形成后,52,行为畸胎学（behavioral teratology） 功能发育毒理学(functional developmental toxicity) 精神畸胎学(psychoterotology) 发育神经毒理学(developmental neurotoxicology) 功能畸胎学(function tertology),其他与发育毒理学有关的术语,53,二、发育各阶段发育毒性作用的特点,（一）着床前期 （二）器官形成期 （三）胎儿期 （四）围生期和出生后的发育期,卵子受精后一直至出生为止，都称为孕体(conceptus),54,（一）着床前期发育毒性,从受精算起，到完成着床之前（人类为11-12天，啮齿类动物为前6天） 通常是未分化细胞受化学毒物损伤而致胚泡死亡，即着床前丢失 也有着床前接触毒物导致畸形的例子，如环氧己烷、甲基亚硝脲等,55,（二）器官形成期（胚胎发育期）,在致畸作用中，对致畸物最敏感的阶段是器官形成期*，一般称为危险期(critical period)或关键期 自受精日计算：人是3-8周；大鼠约为917天；小鼠约为7.516天；家兔为1120天,56,In the 28 days since the sperm has joined with the egg, incredible changes have taken place. The spine is growing, the brain and other organs are developing and the heart is beating.,57,This first few weeks of pregnancy are a period of time when severe damage can be done if a pregnant woman drinks alcohol, smokes, takes drugs, or lacks vitamins from poor nutrition. This is the period when many important organs are developing their internal structure and damage during the period can have long lasting effects.,58,在器官发生期中，致畸物与胚胎接触可能造成形态结构异常；也有可能发生胚胎死亡、生长迟缓,59,发育中的胚胎对致畸作用的敏感期虽然主要在器官发生期，但在此期间，各种不同器官还各有特别敏感的时间，即“靶窗”(target window) 大鼠器官发生期为受精后917天，但眼的最敏感期为受孕后9天，心脏和主动脉弓约为910天,60, 致畸敏感度高， 致畸敏感度低人胚胎主要器官的致畸敏感期,外生殖器,腭,牙,唇,下肢,耳,眼,心脏,中枢神经系统,胚胎发育时期（周，受精龄）,上肢,61,同一剂量的一种致畸物在敏感期中与胚胎接触，可因胚胎所处发育阶段不同而出现不同的畸形 如将大量维生素A在受精后第8天给予大鼠，主要出现骨骼畸形；如在第12天给予，则诱发腭裂,作用时间、剂量、方式！,62,63,（三）胎儿期,器官形成结束后（以硬颚闭合为标志）即进入胎儿期(人类从56-58天起) ，直到分娩 特点：以组织分化、生长和生理学的成熟为主,64,最容易表现的发育毒性是生长迟缓、特异的功能障碍（如神经、内分泌以及免疫系统机能的改变）、经胎盘致癌和偶见死胎 胎仔或胎儿对胚胎致死作用的易感性虽较胚胎为低，但仍有一定数目的死胎发生,65,（四）围生期和出生后的发育期,发育免疫毒性 妊娠期或围生期接触某些外源性化学物，会严重影响出生后T细胞、B细胞和吞噬细胞的发育、迁移、归巢和功能,主要表现：发育免疫毒性、神经行为发育异常和儿童期肿瘤,66,发育神经毒性 表现为对感觉、运动、自主和认知的影响 妊娠期饮酒造成乙醇综合症胎儿 妊娠期安定暴露对F1 代大鼠有一定的发育及神经行为毒性，表现为早期生理发育和神经行为发育滞后等表现,67,儿童期肿瘤 围生期是一生中对致癌物最敏感的时期，许多儿童期高发肿瘤（急性淋巴细胞性白血病、神经母细胞瘤、骶骨前畸胎瘤、胚性腺瘤等）都可能与出生前因素有关 这一时期细胞增殖快，药物代谢酶的个体发生不全，免疫监视功能低,68,三、 母体毒性与发育毒性,69,（一）母体因素对发育毒性的影响,母体毒性(maternal toxicity)是指外源化学物在一定剂量下，对受孕母体产生的损害作用 具体表现：体重减轻、出现某些临床症状、死亡,70,母体毒性作用可分为 轻度母体中毒的表现应限于母体体重下降，正常增长受到抑制。抑制程度不超过不接触受试物对照组动物的10% 严重母体中毒可出现体重增长大幅度抑制、持久性呕吐、过度安静或活动过度、呼吸困难、生育机能明显受损及其它中毒症状，甚至死亡,71,母体因素对发育毒性的影响,1.遗传学 如唇腭裂的发病率依赖于母体的而非胚胎的基因型，白人中的发病率比黑人更高 2.疾病 母体未控制的糖尿病，某些感染，经过间接的疾病相关的母体变化或直接经胎盘的感染对孕体有不利影响,72,3.营养 蛋白质、热量、维生素、微量元素及辅酶因子的缺乏对妊娠产生不利的影响 4.应激 如大鼠、小鼠妊娠期噪声暴露可产生发育毒性。 5.对胎盘的毒性,73,服用过量维生素引起的畸形,维生素A每日服用5万单位（相当于浓缩A丸剂2丸、或浓缩鱼肝油滴剂30滴），连续3个月，会使胎儿骨骼畸形、并趾、腭裂、眼与脑畸形、肾及中枢神经损害,74,叶酸缺乏引起的神通管畸形 （Neural Tube Defects，NTDs）,75,76,母体毒性与胚胎毒性的关系,1.具有致畸作用，但无母体毒性出现，称为非共效应致畸物(non-coeffective teratogen) 此种外源化学物的致畸作用具有特定的作用机理，与母体毒性无关，如反应停 此种受试物致畸作用往往较强，应特别注意,77,2.出现致畸作用的同时也表现母体毒性，称为共效应致畸物(coeffective teratogen) 此种受试物可能既对胚胎有特定的致畸机理，同时也对母体具有损害作用，但二者并无直接联系 3.仅具有母体毒性，但不具有致畸作用,78,4.在一定剂量下，既无母体毒性，也不表现胚胎毒性 应在动物可能耐受条件下，最大限度地增加剂量，使其远远高于人类实际可能接触的水平，如仍未出现致畸作用，才可做出结论,母体毒性与致畸作用的剂量关系之间，并无固定比值；一般情况下，致畸作用剂量较母体毒性作用剂量低,79,四、 发育毒性的剂量-反应模式和 阈值的概念,80,（一）发育毒性的剂量-反应模式,A,胚胎死亡,生长迟缓,结构畸形,B,结构畸形,生长迟缓,胚胎死亡,C,胚胎死亡,生长迟缓,同窝胎仔反应率%,胚胎毒性剂量,0,100,0,100,0,100,较常见,高度致畸作用，较少见,在开始生长迟缓到致死剂量之间，多设实验组，以确证无致畸作用。,81,（二）发育毒性的阈值的概念,发育毒性通常认为是一种阈值现象。假定的阈值低于它就不会发生有害效应的母体的剂量。 发育毒性是否有阈值尚存在争论 (1)很难用实验找出一个发生率很低的剂量-反应关系，因为那需要极大的样本数量，每剂量组几百到几千窝的动物 (2)多数发育毒性机制还不了解，有的已知机制支持阈值的存在，而有些机制则不支持,相对阈值！,82,第三节 致畸（发育毒性）作用机制（Mechanisms of Teratogenic Action）,83,1.干扰基因/蛋白表达 2.基因突变与染色体畸变 3.损伤细胞和分子水平的翻译 4.细胞凋亡,致畸机制是多方面的*,5.干扰细胞-细胞交互作用 6.通过胎盘毒性引起发育毒性 7.干扰母体稳态 8.内分泌干扰作用,84,（一）干扰基因表达,某些基因的表达受到抑制或异常表达可能引起畸形如在培养的小鼠胚胎中用反义寡核苷酸探针抑制或剔除原癌基因Wnt-1或Wnt-3a，都可产生中脑和后脑，或中脑、后脑和脊髓的畸形,85,有些外来化学物作用于生殖细胞或体细胞，可诱发基因突变和染色体畸变，以致DNA的结构和功能受损，造成胚胎正常发育障碍，出现畸形,并具有遗传性。特别是在常规的致畸试验中，胚胎与受试物接触，已进入器官发生期。仅只能作用于体细胞，与生殖细胞无关。,（二）基因突变与染色体畸变,86,CP （cyclophosphamide，环磷酰胺）,PM （phosphoramide mustard）,AC （Acrolein，丙烯醛）,代谢,DNA损伤，DNA-DNA,DNA-蛋白交联,与蛋白质结合,脑积水、露眼、腭裂、 小颌畸形、脐疝、尾部和肢部缺陷,（3H标记CP试验）,87,（三）损伤细胞和分子水平的翻译,细胞增殖 细胞周期,88,（四）细胞凋亡,89,（五）干扰细胞-细胞交互作用,1.,2.,90,反应停的代谢活化产物引起胚胎细胞的粘联受体下调，阻碍发育过程中细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用，干扰了细胞之间的通讯从而导致肢芽结构异常,91,（六）通过胎盘毒性引起发育毒性,对卵黄囊或绒毛膜尿囊胎盘有毒性的毒物有46种，包括镉、砷或汞、香烟、乙醇、可卡因、内毒素、水杨酸钠等,92,（七）干扰母体稳态,二氟苯水杨酸 苯妥英羟基脲孕妇缺乏代谢前体或基质（如维生素、碘的缺乏）,母体贫血、红细胞ATP水平损耗,兔的中轴骨骼缺陷,母体叶酸代谢,致畸,子宫血流减少,胚胎颅面和心包出血,93,（八）内分泌干扰作用,内分泌干扰化学物（Endocrine Disrupting Chemicals，简称EDCs），又称 Environmental Estrogens（环境雌激素） Endocrine Modulators（内分泌调节剂） Xenoestrogens（外源性雌激素） Environmental Endocrine Disrupting Chemicals（简称EDCs，环境内分泌干扰化学物质或环境内分泌干扰化学剂）等 干扰激素的制造、释放、传送、代谢、结合、作用或排除的外源性因子,94,按照EDCs的干扰功能分类,EDCs,雌激素干扰物,雄激素干扰物,甲状腺干扰物,胰岛素干扰物,糖皮质激素干扰物,肾上腺皮质激素干扰物,95, 天然激素化合物：如植物激素大豆异黄酮, 药物 如类固醇类、己烯雌酚、避孕药等。 工农业用原料、产品及排放的废弃物 工业原料：如某些溶剂（如壬基酚）、增塑剂 农用物资：如某些杀虫剂、除草剂、塑料薄膜 生活用品：如塑料、油漆、室内杀虫剂 医用塑料器具：如塑料输液器 汽车尾气、垃圾焚烧,环境中EDCs的来源,96,已注册化学物5500万种，每年新增化学物400万种 已进入环境的常见化学物10万种,97,环境内分泌干扰化学物（EDCs）危害严重！,分布面广量大 难以降解和消除（如POPs） 长期低剂量接触累积效应,98,环境雌激素对生殖系统的发育具有明显的影响 在发育的关键期，环境激素对雌激素和雄激素功能的破坏，可对发育中的生殖器官和其它具有这些激素受体的器官造成永久性的改变,99,1. EDCs与性分化异常,BJU international, 2010 J Biochem, 1998 EHP, 1997,(Disorders of Sex Differentiation),100,EDCs暴露可导致性分化异常,作者收集了在1977到1996年期间潜在暴露于TCDD环境中的人群血清样本，其中包括239名男性样本。研究发现随着男性血清样本中TCDD浓度增高，其子代女性出生比例显著增高 (p = 0.008)。(Mocarelli P, Lancet，2000),作者研究发现在1954-1959年日本水俣市二甲基汞严重污染期间，高暴露人群子代男婴出生率降低，其中男婴2238名，女婴2312名 (p = 0.002)。(Mineshi Sakamoto, Environ Res Sect，2001),作者通过流行病学调查发现，安大略省近Sarnia的Aamjiwnaang第一国立社区近五年内男婴出生比例严重降低，怀疑与长期暴露于周边工厂排放的化学物质有关，其中包含了大量EDCs类化学物质(二噁英、农药等)。(Constanze Mackenzie, Environ Health Perspect，2005),101,2. EDCs与生殖道畸形 （Reproductive Tract Abnormality）,BJU international, 2010 Environ Health Perspect, 2007,102,EDCs暴露可诱发生殖道畸形,出生前暴露于己烯雌酚的雌性小鼠，出生后12-18周出现阴道过度角化、尿道下裂。 (McLachlan JA, Cancer Res, 1980 ),研究发现，患有隐睾症或尿道下裂新生儿的母体胎盘中o, p-DDT (OR = 2.25)、p, p-DDT(OR = 2.63)、林丹(OR = 3.38)、灭蚁灵(OR = 2.85)的水平均显著高于正常新生儿。 (Fernandez MF, Environ Health Perspect, 2007),通过人群研究发现，母亲暴露于DDT，会增加子代患泌尿生殖道畸形的风险 (OR = 1.33)。(Bornman R, BJU Int, 2010),103,DBP Treated,Control,Testis of foetus rat (Proteinogram),A hypospadias rat model has been established and it is easily reproducible,104,3. EDCs与生精障碍(Spermatogenesis Failure),PNAS, 2010 J Toxicol Environ Health A, 2010 Reprod Toxicol, 2009 Toxicology, 2007,105,在佛罗里达，雄性幼年短吻鳄暴露于三氯杀螨醇(dicofol)和DDT后可降低血清睾酮 (T) 水平，发生睾丸组织结构损害及小阴茎。 (Guillette, EHP, 1994 ),在加拿大，雄性白鲸暴露于河水中高浓度的植物类固醇后可导致成熟年龄延迟，性腺体积变小，缺乏第二性征和血清T水平下降。(Martineau, Sci Total Environ, 1994 ),在英国，发现污水处理湖水中雌雄同体鱼，暴露于含有壬基酚和辛基酚乙氧基化物降解产物的雄性虹鳟，其睾丸发育障碍，作为雌性激素暴露生物标志物的血清卵黄素（VTG)水平升高。(Schubert, Aquat Toxicol, 2008 ),EDCs暴露可引起生精障碍,106,EDCs与性功能异常 （Sexual Dysfunction）,Journal of Urology, 2000 Journal of Andrology, 2002 Human Reproduction, 2010,107,利用大鼠作为动物模型研究发现，杀虫剂DDT的代谢产物 p, p-DDE可以显著引起动物勃起功能障碍。(Brien SE, J Urol, 2000)在阿根廷进行的病例对照研究显示，有杀虫剂（DDT、多氯联苯等）暴露史的人群发生勃起障碍的风险更高。(OR=7.1, 95% CI, 1.5-33.0）(Alejandro oliva, J Androl, 2002)在中国进行的双酚A职业暴露人群的队列研究发现，双酚A暴露人群与正常对照比较，发生性欲减退(OR = 3.9, 95% CI, 1.8-8.6)、勃起障碍(OR = 4.5, 95% CI, 2.1-9.8)、射精障碍(OR=7.1, 95% CI, 2.9-17.6)的风险明显增高。(Li D, Hum Ropod, 2010),EDCs暴露可造成性功能异常,108,5. EDCs与生育力下降（Fertility Decline / Infertility ）,全世界约有8 15%的育龄夫妇具有不同程度的生育障碍，不孕不育呈增长趋势。 近50年来，健康成年男性的平均精子数大约减少了50% ，射精精液体积减少。这种变化很可能与日益增多的环境内分泌干扰物（EDCs）有关。,Toxicol Lett, 2010 Hum Reprod, 2009 Environ Sci Technol, 2009 Epidemiology, 2006 Fertil Steril, 2010 EHP, 1996,2003,2006,2010,109,EDCs暴露可引起生育力下降,在青春期前的大鼠染毒实验中，发现滴滴涕的代谢产物（ p,p-DDE ）通过Fas/FasL通路增加了睾丸细胞的凋亡。(Shi YQ ,Toxicol Lett , 2010),通过人群横断面研究，发现暴露邻苯二甲酸单丁酯（MBP）与精子活力下降(P = 0.04)及精子密度下降(P = 0.04)显著相关。(Hauser R, Epidemiology, 2006),在IVF中测定了卵泡液中多氯联苯的含量研究中，发现高暴露组比低暴露组卵母细胞的受精率减少了15%，冰冻胚胎的数量减少了27%。 (Simona Jirsov, Fertil Steril, 2010),110,6. EDCs与自然流产(Spontaneous Abortion)/死胎(Stillbirth),Clin Biochem, 2010EHP, 2008J Reprod Develop, 2007Am J Epidemiol, 2005,111,EDCs暴露可增加发生自然流产/死胎的风险,通过病例对照研究，发现患者血清中的BPA水平(MeanSD:2.595.23ng/ml) 明显高于正常妊娠者(0.77 0.38ng/ml,P=0.024),高水平BPA暴露会增加发生自然流产的风险。 (Mayumi Sugiura-Ogasawara, Hum Reprod, 2005),通过病例对照研究发现，PCBs/PCDFs的人群高水平暴露 ,会增加发生自然流产的风险 (OR = 2.28; 95% CI, 1.094.75) / (OR = 1.60; 95% CI, 1.102.33) 。(Kiyomi Tsukimori, EHP, 2008),通过队列研究发现，暴露于DDT (36.6-113.3ng/g) 后发生自然流产的风险明显升高 (OR = 2.12; 95% CI, 1.263.57)。血清中DDT水平每增加10ng/g,发生自然流产的相对危险性增加1.17 (95% CI, 1.051.29)。 (Scott A.Venners, Am J Epidemiol, 2005),112,7. EDCs与出生缺陷(Birth Defects),Toxicol Sci. 2008 Am J Epidemiol. 2006 Eur J Epidemiol. 2010 Congenit Anom. 2008,113,EDCs暴露可增加胎儿出生缺陷的风险,通过分析研究发现，父亲暴露于橙剂，发生胎儿脊柱裂的风险高于对照组(OR = 2.02)。(Ngo AD, Eur J Epidemiol. 2010),通过病例对照研究发现，母亲暴露酰胺(OR = 3.3)，苯并咪唑(OR = 2.7)，氨基甲酸甲酯(OR = 1.7)，发生胎儿脊柱裂的风险高于对照组。(Rull RP, Am J Epidemiol. 2006),通过斑马鱼染毒模型研究发现，暴露于PCB126 会产生包括房室瓣形成异常和动脉球减少的心脏畸形。 (Grimes AC, Toxicol Sci. 2008 ),通过小鼠染毒模型研究发现，暴露于TCDD 会导致内侧缘上皮细胞形态学和分子机制的改变，从而产生唇腭裂畸形。(Fujiwara K, Congenit Anom. 2008 ),114,第四节 发育毒性和致畸作用 试验与评价,115,致畸的物种个体差异,任何环境有害因素的损害效应都存在物种及个体差异。但在致畸作用中较突出。同一物种动物的不同品系对一种致畸物敏感性的差别很大。 物种及种间差异，可能是由于遗传因素，即基因型差异。 化学物的致畸作用以及发育毒性的评定，主要通过动物试验得出评定结果后推论到人类。致畸作用物种品系差异，可能存在对动物不具致畸, 但对人类有致畸作用，动物致畸试验结果推论到人类造成某些困难。所以对致畸作用的全面评定，必须采用两种动物进行试验，还要进行人群调查。,116,一、动物发育毒性试验,致畸是发育毒性中最重要的一种表现。所以发育毒性的评定，主要是通过致畸试验。传统常规致畸试验是评定致畸作用的标准方法。 1966年FDA提出人体使用药物生殖毒性安全性评价的三段试验 1995年提出检测人用医药产品生殖毒性的ICH三阶段试验 1998年美环保署发布了改进的发育神经毒性的大鼠试验程序,117,明确受试物是否有生殖发育毒性，而且要在已知其具有发育毒性时，确定其对后代的NOAEL及剂量-反应关系。 最佳联合方案是对成年动物进行染毒并包括子代从受精卵到性成熟所有生长发育阶段；观察期应贯穿一个完整的生命周期，以检测近、远期效应。 最常选用的方案为三阶段一代繁殖试验 食品添加剂要求多代实验,118,I阶段（生育力与生殖功能试验）：雌雄性交配前-受孕-雌性受精-雌性着床期间染毒，研究对成年雌雄性生殖功能、配子的发生及成熟、交配行为、受精、着床前的发育和着床的影响 II阶段（致畸作用和胚胎毒性的评定）：从着床到硬颚闭合期间染毒，研究对成年雌性生殖功能、胚胎发育、器官形成期的发育毒性。 III阶段（围生期及出生后发育情况试验）：从着床到幼仔断乳期间对孕母(及乳母)染毒，研究包括从着床到子代性成熟的母体生殖毒性和子代的发育毒性,119,二、流行病学研究和人类证据,人类证据的获得：病例报告、出生缺陷登记28个人类化学致畸物中有23个是病例报告提出了第一证据。11个人类化学致畸物，发育毒性的人类证据领先于发表的动物证据。 对老污染物采用回顾性或横断面调查。,发育毒性研究的2个方案！,120,妊娠前,出生后,发育毒性相关队列研究,子代 结局,妊娠期 暴露,121,美军喷洒“落叶剂”,胡志明市的一位畸形儿,越战后出生的残疾儿童,越战“橙剂”后遗症,122,越战初期，美军屡遭藏匿在森林中的越南游击队突袭，伤亡惨重。于是，美军开始使用“橙剂”，即“落叶剂”。1962年至1971年，美军通过空中喷洒、水道灌输等方式，共向越南投放了4000万升“橙剂”。 1969年动物试验发现，“橙剂”会导致动物的后代出现生理缺陷，于是尼克松总统在1970年下令美军停止喷洒这种落叶剂。,123,越战1973年结束后，越南境内身患怪病的人数剧增，至少100万人身染怪疾，如精神错乱、各种癌症、生育能力降低或丧失等，此后诞生的畸形儿数量也达到十几万之巨。 研究发现，二恶英污染是使大量越南和美国新生儿出现四肢畸形、发育迟缓、脑力迟钝等缺陷的主要原因，而“橙剂”中就含有被认为是世界上毒性最大的物质之一的二恶英。,124,橙剂具有致畸副作用被美国政府掩盖起来。直到七八十年代，许多越战老兵得了不知名的怪病，而他们的后代也出现了不同程度的生理缺陷后，一个代表两万名老兵的团体状告生产落叶剂的DOW化学公司和MONSANDO公司，并最终获得了1.8亿美元的赔偿。 尽管越战结束已30多年了，但越战中的落叶剂不仅使大批美国和越南军人深受其害，而且给许多越南平民的后代带来遗传病患。,125,据越南调查结果显示，越战中因沾染化学毒剂而造成各种后遗症的人至今仍有近4万名，有1.4万个家庭生下了2万多名先天残疾的后代，其中包括畸形、瘫痪和神经性疾病患者。研究表明，在喷洒过橙剂的地区，死胎和流产现象猛增倍。 美国政府一直拒绝承认“橙剂”是导致越南人所生孩子有缺陷的原因，也不承认“橙剂”造成越南人罹患的种种怪病。,126,发育毒性资料的使用-常见有致畸作用的10类药物,抗惊厥和抗癫痫药：苯妥英钠可引起先天性畸形：短鼻，鼻梁宽而扁平、眼距过宽、眼睑下垂、斜视、短颈、唇裂或腭裂、小头畸形、智力低下等。苯巴比妥类与苯妥英钠类合用可能加重致畸作用， 碳酸锂：治疗躁狂症的常用药物。特别是心血管畸形的发生率明显高于正常人群。,127,己烯雌酚：治疗更年期综合征。可引起新生儿生殖器畸形。大部分畸形在青春期开始显现，90%以上在15-28岁有明确诊断，平均年龄为19 岁。 口服避孕药：是目前使用最广泛的女性避孕方法之一。但孕妇使用此类药物可引起包括肢体、心血管和神经系统的多种畸形。,128,抗生素：链霉素可能导致新生儿第八对脑神经损害，其损害程度与使用时间有关。四环素可引起胎儿牙齿和骨骼发育不全。 维生素A类：具有广泛的生物活性和重要生理功能。过量的维生素A类可引起不同种属实验动物的先天性畸形，妊娠期每日5000国际单位维生素A的需求完全可在摄食中获得，不必另外补充。一次大剂量或长时间大剂量服用均属不当。 抗凝药：维生素K、肝素和香豆素类等临床常用的抗凝药中香豆素已被肯定具有致畸作用。,129,抗恶性肿瘤药：甲氨蝶呤已肯定具有致畸作用，引起畸形的机制是干扰人体叶酸代谢，补充适量的叶酸可能有预防作用。 糖皮质激素：妊娠早期使用糖皮质激素的孕妇，可引起新生儿腭裂。地塞米松、倍他米松和去炎松能使小鼠产生腭裂，而强的松龙和氢化可的松很少使小鼠产生腭裂。 抗甲状腺药：硫氧嘧啶类抗甲状腺药可使先天性畸形增加，表现为头皮和头发缺损。,130,前苏联切尔诺贝利核电站,物理因素的发育毒性,131,10倍：绿色和平组织称切尔诺贝利核泄漏危害被低估10倍； 800年：专家称消除切尔诺贝利核泄事故漏后遗症需800年； 9.3万人：20年前的切尔诺贝利核电站事故造成致癌死亡人数约为9.3万人左右； 27万人：27万人因切尔诺贝利核泄漏事故患上癌症，其中致死9.3万人； 34万人：核泄漏事故发生后，前苏联立即疏散了11万多人，随后数年，又从污染严重地区搬迁了23万人，前后共疏散34万余人； 20亿人：建立在白俄罗斯国家科学院研究成果上的报告说，全球共有20亿人口受切尔诺贝利事故影响。,132,20年过去了，切尔诺贝利核事故造成的生态灾难后果远未消逝。乌克兰全国4800万人口中，目前共有包括47.34万儿童在内的250万核辐射受害者处于医疗监督之下。导致甲状腺癌的发病率增加了10倍多。更令人担忧的是，核辐射受害者中残疾病例上升：1991年至今，核事故导致残疾的人数增加了1.6倍，达10万人。而核事故发生时1岁至18岁的受害者健康问题最为突出，这一群体甲状腺癌的发病率比核事故前高10至60倍。,133,三、发育毒性的替代试验,实验方法的限制 动物福利的需要 实验准确性的要求,134,替代方法的概念与内涵,在生物医学研究、检测或教育中凡是能替代实验动物、减少所需动物数量或使动物实验程序得以优化而减少动物痛苦的任何一种方法或程序，都被认定为是替代方法（Alternatives methods） 代替替代（Replacement alternative） 减少替代（Reduction alternative） 优化替代（Refinement alternative） 包括用组织学、胚胎学、细胞学或计算机等方法取代整体动物实验，以低等动物取代高等级动物,135,替代的基本方法,体外技术及人类模型的应用 不依赖于完整动物的使用，如原代培养细胞、组织和器官、细胞系等 人类组织库、捐献器官、尸检材料等 人类胚胎干细胞 低等物种的利用 植物、细菌、真菌、昆虫或软体动物等 秀丽线虫(Caenorhabditis elegans) 斑马鱼(Danio rerio, Zebrafish) 物理化学方法与计算机的使用 QSAR 模型,136,三、发育毒性的替代试验预筛试验,体外预筛试验 由于删除了母体毒物动力学、生物转化，以及胎盘屏障的影响，因此其可靠性受到一定的怀疑,137,而对于不存在母体毒性的致畸物，其可靠性稍高 另一方面，对于发现致畸作用的靶器官，或阐明致畸作用方式与机制，则比传统致畸试验有一定的优越性,138,全胚培养 器官培养 细胞培养,常见体外预筛试验有如下3种,139,（一）全胚培养 技术难度大，费用高,啮齿类全胚培养 可用孕d9-d10的大鼠胚或孕d8-d9的小鼠胚。此法经Schmid和Cicurel进行可靠性验证，灵敏度为100%，特异度分别为95.2%和42.1%,140,其他脊椎动物全胚培养 曾用于致畸试验的鱼有：日本medaka、斑马鱼、虹鳟鱼、肥头鱼等。由于所有脊椎动物的发育过程基本共通，而有些鱼的卵带有透明的卵壳，提供了很好的观察系统 非脊椎动物全胚培养 如果蝇、水螅的试验系统有过可靠性验证,141,Assessing the effects of phthalates on thyroid hormone system using Xenopus laevis:Groups of 20 tadpoles reached stage 51 were placed in water containing nominal concentrations of 2, 10, 15 mg/L DBP and MBP, 1nM T3 and 0.005% DMSO for 21 days.,Amphibian Metamorphosis (Xenopus laevis),Toxic effects of phenols & PBDEs on preimplantation embryos,Functional indexes,supernatant of embryo culture: hormone levels, cell factor embryo: miRNA expression, target gene/protein expression, enzyme,mESCs hESCs,Zebrafish,142,143,猕猴交配实验,整体实验环境符合相关标准及要求 AAALAC认证 屏障系统，进排风、给水、饲料等按要求过滤和消毒 恒温、恒湿、人工昼夜，专职饲养人员负责饲养和管理 动物单笼饲养,144,Control,E,57,134,受精情况,卵裂情况,囊胚形成情况,10/11,5/11,11/11,11/11,10/11,5/11,10/11,10/11,3/11,1/11,5/11,3/11,144,145,（二）器官培养,可观察不同器官的特异分化与发育过程 器官培养有静态法和混悬培养法，用作研究对象的器官和组织有小至晶状体、牙和大至肝、肺、肠等共十多种 其中以肢芽培养法在方法学上最为完备，已提出过骨原基和指(趾)的计分方案和图像分析,146,（三）细胞培养,细胞微团培养 是用胚胎某部分组织的原代细胞进行高密度培养的办法 使用的细胞有大鼠中脑原代细胞、肢芽区或其他区细胞,147,人胚干细胞培养Tomson1998年从人胚泡建立了人胚干细胞，试图以此解决啮齿类与人在胚胎发育与成体结构差异方面的问题,ESCs（D3）& EB,EDCs Exposed (BPA/PBDEs),morphology,Cytotoxicity,pluripotency,Cell viability,Apoptosis,Cell cycle,AP staining,Cell pluripotency marker,1481,1491,150,Welcome to our research group & Thank you for your attention!,