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阪崎肠杆菌检验,.,本标准与GB/T 4789.40-2008 相比，主要变化如下：修改了标准的中英文名称；删除了附录A 中A.3。,.,Enterobacter sakazakii(ES),.,内容,第一部分：一般特征第二部分：流行病学特征第三部分：ES的检验,.,第一部分：一般特征,命名培养特征生化反应抵抗力增殖能力致病性,.,1980年之前一直被称为黄色阴沟肠杆菌。DNA-DNA杂交生化反应黄色素抗生素敏感性,一、命名,.,二、培养特征,G无芽孢杆菌，兼性厌氧，在6-47范围内均可生长，适温35-37营养要求不高： VRBGA、TSA、NA、MAC、EMB、其他与其他常见肠杆菌相似,.,三、生化反应,.,注： ：90-100；() ：75-89%； V ：25-74；()：10 -24； ：0-9,.,第三部分,食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验,.,主要内容,一、制订的主要依据二、食品卫生微生物学检验 阪崎肠杆菌检验,.,制订的主要依据,ISO 2006年“乳和乳制品中阪崎肠杆菌的检测”（Milk and milk productsDetection of Enterobacter sakazakii）方法；美国FDA 2002年颁布的“婴儿配方粉中阪崎肠杆菌的分离和计数”（Isolation and Enumeration of Enterobacter sakazakii from Dehydrated Powdered Infant Formula）方法；2004年荷兰乳及乳制品控制中心对各种阪崎肠杆菌检测方法的比较研究；雀巢研究中心2005年环境样品中阪崎肠杆菌快速检测方法；阪崎肠杆菌快速检测培养基DFI研究资料。,.,SN第一部分：分离与计数方法 第二部分：PCR方法 第三部分：荧光PCR方法,.,常见选择性培养基,DFI (Oxoid, UK)ESIA (AES, France)RF（R&F Laboratories，Switzerland）OK medium其他：国内阪崎肠杆菌显色培养基、CES (Merck, Germany)，NA+ -MUG,.,显色培养基的特点,-葡萄糖苷酶活性指示剂：5-溴-4-氯-3-吲哚-，D-吡喃葡糖甙（XGlc）4-甲基伞形酮-D-葡糖苷（-MUG）4-邻硝基苯-D-吡喃葡糖甙,.,.,选择性培养基的选择,1. FDA方法使用VRBGA，ISO 方法中使用ESIA，本方法中我们选用DFI。2.ESIA和DFI的基本原理相似，二者都是根据ES能产生-葡萄糖苷酶，分解底物XaGlc产生有色菌落。3.VRBGA对ES的选择性差，ES、阴沟肠杆菌和成团肠杆菌等多种肠道菌都可以在该平板上生长并产生粉紫色菌落，胆汁酸沉淀形成紫色晕圈。即：不能观察到ES的特征性菌落。,.,显色培养基的选择性较好DFI对ES的选择性较好，ES形成的蓝绿色特征性菌落易于辨认，而且：硫化氢指示剂可以区分ES和产生少量-葡萄糖苷酶但H2S阳性菌株（如普通变形杆菌）。ES都可以在DFI平板上生长并产生蓝绿色菌落其他常见菌在DFI平板的菌落颜色白色菌落：肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希氏菌、泛菌属的多种菌等黄色菌落：赫氏埃希氏菌黑褐色、粉色或中心蓝绿菌落：少量菌种ESIA:蓝色，1-3mm,18,.,选择性增菌肉汤的选择,FDA方法选择EE肉汤，ISO方法选择mLST-Vm，即在LST中加入Nacl和Vm。本标准使用mLST-Vm。EE肉汤适合所有肠道菌群的生长繁殖，这就可能对ES的生长产生竞争性抑制作用，降低检出率。研究证明与其他肠杆菌科细菌（如沙门氏菌，大肠埃希氏菌等）相比，ES具有较高的耐渗透压能力。加入0.5M的Nacl在保证ES良好生长的同时，可以有效地抑制上述其他细菌的生长。Vm可有效地抑制G+菌的生长。而较高的生长温度可以进一步抑制其他细菌的生长。,.,二、食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验,.,本标准修改采用,ISO/TS 22964 （ 1st edition 2006-02-01 ）Milk and milk products Detection of Enterobacter sakazakiiFDA July 2002; Revised August 2002 Isolation and Enumeration of Enterobacter sakazakii from Dehydrated Powdered Infant Formula,.,第一法：阪崎肠杆菌的检验第二法：阪崎肠杆菌的计数,.,第一法 阪崎肠杆菌的检验,.,阪崎肠杆菌检验程序,前增菌,选择性增菌,选择性分离,生化鉴定,100 g（ mL ）,.,5.1 前增菌和增菌,左图：未混合； 右图：混合后。,加样入已预热到44的BP中,.,5.2 分离,DFI36124 h2h,.,TSA： 25 培养后典型ES：黄色阴性对照E. coli ATCC 25922：白色菌落,黄色素,.,5.3 鉴定（生化反应）,.,商业生化鉴定系统的应用,推荐使用的ES生化鉴定方法有很多，主要有API 20E，ID 32E，Biolog GN2 MicroPlate，VITEK GNI+等。上述方法都比较成熟，稳定性较好，已被许多国家和组织的标准采用。在肠杆菌的生化鉴定中使用最广泛的是API 20E和Vitek GNI+。,.,API 20E生化鉴定板典型生化反应图示,.,VITEK-GNI+,.,质量控制,选择标准菌株作为阳性对照，检测增菌液和分离培养基对阪崎肠杆菌生长的影响和生化鉴定结果，对整个实验的操作过程进行质量控制。,.,第二法 阪崎肠杆菌的计数,.,3管MPN法,.,SN标准,.,谢谢,.,
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