食品毒理学(致突变).ppt

1,掌握致突变作用的概念和突变的类型熟悉致突变作用的后果熟悉致突变作用评价方法了解致突变作用的遗传学基础,【目的要求】,2,基本概念：突变、遗传毒理学、致突变作用、致突变物致突变的类型：基因突变、畸变、染色体数目改变,【内容】,3,致突变作用机制突变的后果：生殖细胞突变，体细胞突变机体对致突变作用的影响致突变试验,4,第一节概述,5,遗传和变异,遗传：亲代能产生与自己相似的后代的现象叫做遗传。即俗语所说的“种瓜得瓜，种豆得豆”。遗传是保持种族特性的根本，但遗传的稳定性是相对的。变异：亲代与子代之间、子代的个体之间，是绝对不会完全相同的，总是或多或少地存在着差异，这样现象叫变异。即俗语所说的“一母生九子，九子各不同”。变异是生物体推陈出新的来源。可遗传的变异（由遗传结构本身的变化引起的）突变不可遗传的变异（由环境因素引起的变化）,6,孟德尔为现代遗传学奠定了基础,7,孟德尔通过豌豆杂交实验，用抽象的遗传因子来分析实验结果，揭示了单个性状遗传的法则：分离定律和多个性状遗传的法则：自由组合定律。,8,基因与染色体,在孟德尔的成果获得承认后，生物界都知道是遗传因子（即基因）决定了生物性状的遗传。但是，基因究竟在细胞内的什么地方？摩尔根以果蝇为试验对象回答了这一问题，基因在染色体上。,摩尔根(Morgan)以黑腹果蝇为材料所进行的一系列实验，导致了遗传学的许多重大发现。由于在染色体遗传理论上的贡献，摩尔根于1933年获诺贝尔医学和生理学奖，这是遗传学领域的第一个诺贝尔奖。,9,10,摩尔根在基因论中绘制了果蝇基因位置图，首次完成了当时最新的基因概念的描述：基因是在染色体上呈线性排列的遗传单位，它不仅是决定性状的功能单位，也是一个突变单位和交换单位。至此，人们对基因概念的理解更加具体和丰富了。,11,摩尔根果蝇遗传实验具有划时代意义,人类第一次把基因与染色体联系起来，认为基因是一种物质，是染色体上的一个特定的区段。确立并发展了染色体的遗传理论。,12,13,14,AGTC,腺嘌呤鸟嘌呤胸腺嘧啶胞嘧啶,15,DNA的半保留复制,16,转录,翻译,信使RNA5端,编码链3端,氨基酸链,DNA遗传信息的转录和翻译,17,5端,3端,18,突变（mutation)：是指遗传物质本身的变化及其引起的可遗传的变异。因为这种变化起源于基因和染色体，因此，是可遗传的变异1901年DeVries首次提出突变这一术语,一、基本概念,19,自发突变(spontaneousmutation):是由于普遍存在的未知因素作用下，在自然条件下发生的突变。如1909年摩尔根发现在红眼果蝇中有白眼果蝇特点：发生过程长、频率很低，与物种进化有关,从发生原因上，可分为：,20,诱发突变(inducedmutation)：是指人为地造成突变。如太空育种特点：发生过程短、频率高，既可被人类利用，也可能对人类产生危害,21,突变研究简史,22,致突变作用（mutagenesis)：是指外来因素特别是化学因子引起细胞核中的遗传物质发生改变的能力，而且此种改变可随同细胞分裂过程而传递。致突变物(mutagen)：凡能引起生物体遗传物质发生改变的化学物质或任何环境因子，又称诱变剂。,遗传毒性(genotoxicity）：遗传毒性是指对基因组的损害能力，包括对基因组毒作用引起的致突变性及其他各种不同效应。遗传毒物（genotoxicagent)：具有遗传毒性的化学物质称为遗传毒物。遗传毒性和致突变性既有联系又有区别。遗传毒性包括但不限于致突变性，前者更偏重于对作用机制的描述，包含的范围更宽泛；后者偏重于对作用后果的描述，遗传毒性的效应可能转变（固定）为突变，也可能被修复或表现为其他后果。因此，在实际运用中两者经常被混淆。致突变物能引起遗传物质的改变，具有遗传毒性，属于遗传毒物。,24,1927年，Muller推测体细胞突变可致癌，直到60年代，人们才认识到致突变作用和其他遗传毒性可能给生物体带来各种各样的健康危害，随之产生了一门新学科：遗传毒理学(genetictoxicology)：研究化学性和放射性物质的致突变作用以及人类接触致突变物可能引起的健康效应的科学,25,直接致突变物（direct-actingmutagen)：具有很高的化学活性，其原型就可引起生物体突变的物质间接致突变物（indirect-actingmutagen)：本身不能引起突变，必须在体内经过代谢活化，才具有致突变性的物质,26,第二节化学毒物致突变的类型,从遗传学角度或突变角度分为：基因突变染色体畸变（染色体结构改变）非整倍体和多倍体（染色体数目改变）,27,也可以从机理角度分为：对DNA为靶的损伤（包括基因突变、染色体畸变）不以DNA为靶的损伤(染色体数目改变）,28,从损伤大小角度可分为：不可用光学显微镜观察的：基因突变可用光学显微镜观察的：染色体畸变（染色体结构改变）、非整倍体和多倍体（染色体数目改变）,29,基因突变（geneticmutation)：是指基因在结构上发生了碱基对组成和排列序列的改变（pointmutation)可分为碱基置换和移码突变两种类型突变基因：基因内存在突变的基因野生型基因：没有发生突变的基因,一、基因突变,30,(一)碱基置换（basesubsititution),转换(transition)：即嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶的变化颠换(transversion):即嘌呤到嘧啶或嘧啶到嘌呤的变化,碱基置换是某一碱基配对性能改变或脱落而引起的突变，简而言之，就是不正确的碱基取代了正确的碱基。,31,Transitionsaremorecommonthantransversions,32,33,碱基置换突变的后果同义突变(synonymousmutation)：指没有改变基因产物氨基酸序列的改变（无影响）错义突变(missensemutation)：指碱基序列的改变引起了产物氨基酸序列的改变（严重程度不等）无义突变(nonsensemutation)：指某个碱基的改变使代表某个氨基酸的密码子变为蛋白质合成的终止密码子，导致多肽链在成熟之前终止合成的改变（常比较严重）,34,致死突变：发生在必需基因的重要氨基酸位点上，将严重影响蛋白质功能,渗漏突变：突变的产物仍有部分活性，表现型介于突变型与野生型之间,中性突变：突变不影响或基本不影响蛋白质的功能，性状改变不明显,错义突变,35,无义突变,36,“终止密码突变”链终止突变：指无义突变使肽链过早终止延长突变：指如果终止密码子因突变而为氨基酸编码，结果产生过长的肽链的现象,37,指发生一对或几对不等于3的倍数的碱基减少或增加，以致从受损点开始碱基序列完全改变，形成错误的密码，并转译为不正常的氨基酸由于碱基序列所形成的一系列三联体密码子相互间并无标点符号，于是从受损位点开始密码子的阅读框架完全改变,（二）移码突变（frameshiftmutation),38,39,移码突变的结果：严重使读码框架改变，从原始损伤的密码子开始一直到信息末端的氨基酸序列完全改变若其中某一点形成无义密码，则产生一个无功能的肽链片段移码产生严重的大范围的错义或无义密码，较易成为致死性突变,40,注意：如果减少或增加碱基对刚好是3对，则基因产物的肽链中仅减少或增加一个氨基酸，其后果与碱基置换相似，与移码突变不一样，不包括在移码突变范畴，称为密码子的缺失或插入。,41,42,二、染色体畸变（染色体结构异常）,43,染色体畸变（结构异常）（structuralchromosomeaberration）：是指由于染色体或染色单体断裂，造成染色体或染色单体缺失或引起各种重排，从而出现染色体结构异常断裂剂：凡能引起染色体断裂的物质断裂作用：染色体断裂的发生或过程,44,染色体畸变又可分为染色体型畸变（chromosome-typeaberrations)：指染色体中两条染色单体同一位点受损后所产生的结构异常染色单体型畸变（chromatid-typeaberrations)：指畸变涉及复制后的染色体中两条染色单体中的一条产生何种畸变取决于损伤发生在染色体复制前还是复制后。,45,(1)裂隙和断裂：都是指染色体上狭窄的非染色带过去以带宽超过染色单体宽度为断裂，不超过者为裂隙,染色体畸变的类型,46,(2)无着丝粒断片和缺失（deletion)一个染色体发生一次或多次断裂而不重接，并且这些已断裂的节段远远分开，就会出现一个或多个无着丝粒断片和一个缺失了部分染色质并带有着丝粒的异常染色体，后者称为带着丝粒断片,47,常将无着丝粒断片简称为断片，在下一次细胞分裂时断片因无着丝粒，故不能进入分裂的核中而滞留在细胞质中，称为微核如断片很小，小于染色单体宽度，则称为微小体,48,(3)环状染色体：染色体两臂各发生一次断裂，其带有着丝粒的节段的两断端连接形成一个环时，称为环状染色体(4)易位(translocation)：从某个染色体断下的节段接到另一染色体上称为易位,49,(5)插入和重复：当同一对染色体中发生三处断裂，带有两断端的断片插入到另一臂或另一染色体的断裂处重接起来，称为插入,缺失,插入和重复,倒位,(6)倒位(inversion)：当某一染色体发生两次断裂后，其中间节段倒转180再重接，称为倒位,50,染色体畸变（结构异常）是染色体或染色单体断裂所致。当断端不发生重接或虽重接而不在原处，即可出现染色体畸变。,51,三、非整倍体和多倍体（染色体数目异常）,NormalhumanKaryotype:46,XY,动物正常体细胞染色体数目2n为标准，为二倍体，又称双体（disomy）。,52,染色体数目异常可能表现为：整倍性畸变：可能出现单倍体、三倍体或四倍体。超过二倍体的整倍性畸变也统称为多倍体。非整倍性畸变：系指比二倍体多或少一条或多条染色体,53,整倍性畸变,54,缺体是指缺少一对同源染色体，单体或三体系指某一对同源染色体相应地少或多一个，四体则指其比同源染色体多一对；于是在染色体数目上相应为2n-2、2n-1，2n+1和2n+2人类中常见有三种三体：（1）21-三体，即Down氏综合征；（2）18-三体，即Edward综合征（3）13-三体，即Patau综合征。,55,染色体数目异常的基本类型,56,染色体分裂过程异常是产生非整倍体和多倍体的原因！,57,非整倍性畸变,58,第三节化学毒物致突变作用的机制及后果,59,（一）碱基损伤1.烷化剂(alkylatingagent):是指对DNA和蛋白质具有强烈烷化作用的物质一般情况下甲基化乙基化高碳烷基化烷化剂所致甲基化易产生碱基错配，引起突变烷化碱基易脱落，形成AP位点，引起突变N位烷化可引起染色体畸变,一、引起突变的DNA变化(以DNA为靶的损伤机制),60,目前认为最常受到烷化的是鸟嘌呤的N7位，其次是O6位腺嘌呤的N1、N3和N7也易烷化,腺嘌呤鸟嘌呤,61,AP位点（apurinicorapyrimidinicsite)：是指丢失碱基的DNA留下了一个无嘌呤或无嘧啶的位点,62,有些化学物的结构与碱基非常相似，称碱基类似物它们能在S期中可与天然碱基竞争，并取代其位置，取代后碱基类似物常造成错误配对，发生碱基置换例如5溴脱氧尿嘧啶核苷能取代胸腺嘧啶；2氨基嘌呤(2-AP）能取代鸟嘌呤,2.碱基类似物取代,63,化学物可对碱基产生氧化作用，从而破坏或改变碱基的结构，进而引起碱基置换，有时还引起链断裂有些化学物质可在体内形成有机过氧化物或自由基，如甲醛、氨基甲酸乙酯和乙氧咖啡碱等，可间接使嘌呤的化学结构破坏，容易出现DNA链断裂,3.碱基的化学结构的改变或破坏,64,嵌入剂（intercalatingagent)：指能以静电吸附形式嵌入DNA单链的碱基之间或DNA双螺旋结构的相邻多核苷酸链之间的物质如丫啶类染料分子多数是多环的平面结构，特别是三环结构，其长度为6.8102nm，恰好是DNA单链相邻碱基距离的两倍通常引起移码突变,（二）平面大分子嵌入DNA链,65,（三）DNA链受损,1.二聚体的形成：紫外线环丁烷嘧啶和4-6光产物阻止DNA复制引起细胞死亡,66,活性化学物质与细胞大分子之间通过共价键形成的稳定复合物，难以解离。如生物毒素、多环芳烃和芳香胺类致癌物可使DNA形成大加合物，使DNA的立体构象发生明显变化，阻断受损部位的半保留复制和转录，可引起基因突变，活化癌基因，影响抑癌基因等表达,2.DNA加合物形成,67,4.DNA-蛋白质交联（DNA-proteincrosslinks，DPC）：对DNA构象和功能产生严重影响。如亚硝酸、丝裂霉素C、氮和硫的芥子气以及各种铂的衍生物,3.DNA-DNA交联（DNA-DNAcrosslinks，DDC）：DNA分子上一条链的碱基与互补链上的相应碱基形成共价连接,68,二、引起突变的细胞分裂过程改变（不以DNA为靶的损伤机制）是染色体数目改变的原因,a是中心粒，b是纺锤丝，c是染色体，d是着丝点。纺锤丝把着丝点（内部已经一分为二）拉开，复制过的染色体就一分为二了。,69,一些化学物能作用于纺锤体，中心粒或其他核内细胞器，从而干扰有丝分裂过程，诱发这种作用的物质称为有丝分裂毒物，又称干扰剂。有些干扰剂仅使细胞群体的有丝分裂数减少，被称之为抗有丝分裂剂。,70,无论纺锤体是部分或完全受抑制，都称为有丝分裂效应。完全抑制时细胞分裂完全抑制，细胞停滞于分裂中期。秋水仙碱是典型的引起细胞分裂完全抑制的物质，因此这种效应又称秋水仙碱效应。,71,致突变物对纺锤体功能的干扰可包括,与微管蛋白二聚体结合与微管上的巯基结合破坏已组装的微管妨碍中心粒移动其他作用,72,1.不分离（nondisjunction),一种是同源染色体在减数分裂第一次分裂中期联会复合中不分离（可能联会复合体受损），不分离的结果是纺锤体的一极接受了一对同源染色体，而另一极则没有。,73,另一种是姊妹染色单体在有丝分裂中或减数分裂第二次分裂中因着丝粒受损未纵裂而不分离，两条姊妹染色单体进入同一个子细胞，而另一个子细胞中则没有该染色单体,74,2.染色体丢失（chromosomeloss)纺锤体形成的不完全障碍或着丝粒受损使细胞分裂过程中个别染色体行动滞后没有进入子细胞核,3.联会复合体形成障碍和减数分裂第一次分裂时着丝粒早熟分离而产生非整倍性,75,4.核内复制和减数分裂失败引起整倍体（endoreduplication),核内复制是指在一次细胞分裂时，核膜不发生分裂，或者是染色体复制两次或多次，这是发生核内多倍化的原因。,在细胞增殖过程，细胞周期正常染色体复制，但在接下来的有丝分裂期，染色体分裂时，由于某些原因，染色单体不能分离，产生一个4倍体的细胞。,在配子形成过程中，由于分裂错误，减数分裂失败，配子为2倍体，而不是单倍体，所以会产生一个多倍体的受精卵，随之产生一个多倍体的子代。,76,三、其他的致突变途径,对DNA合成和修复有关的酶系统的作用,一些氨基酸类似物可使与DNA合成有关的酶系统遭受破坏从而诱发突变，脱氧核糖核苷三磷酸在DNA合成时的不平衡也可诱发突变铍和锰除可直接与DNA相互作用外，还可与酶促防错修复系统相作用而产生突变对组蛋白和非组蛋白功能的影响,77,四、突变的后果,突变的后果取决于化学毒物所作用的靶细胞体细胞：其影响仅能在直接接触该物质的个体身体上表现出来，不可能遗传到下一代（如肿瘤）生殖细胞：其影响有可能遗传到下一代（如遗传性疾病）,78,DNA损伤修复障碍,体细胞突变,生殖细胞突变,良性肿瘤,恶性转化,细胞衰老,未分化的胚胎细胞,分化的胚胎细胞受损,显性致死,隐性致死,存活突变,动脉硬化,未知疾病,癌变,老化,出生缺陷（功能或结构畸形）癌变,流产/死胎,出生缺陷（功能或结构畸形）,流产死产,出生缺陷基因负荷,先天性疾病,化学物遗传危害示意图,79,（1）致死性突变：显性致死：精子不能受精，或突变配子与正常配子结合后，在着床前或着床后的早期胚胎死亡。基因的致死作用在杂合子中即可表现的称为显性致死。隐性致死：需要纯合子或半合子才能出现死亡效应，杂合子则不出现死亡。,1.生殖细胞突变的后果,80,（2）非致死性突变（可遗传的改变）先天畸形等遗传性疾病遗传易感性改变,致死性突变将导致死胎，它影响后代的数量而非质量。非致死性突变主要影响后代的质量。,81,生物个体生殖细胞发生突变或染色体畸变后，有些可能会在世代传递、选择过程中在人群中固定下来，增加人类的遗传负荷遗传负荷（geneticload)：指人群中每个个体所携带有害基因或致死基因的平均水平,82,（1）癌变：体细胞突变是细胞癌变的重要基础，在许多肿瘤中，都可观察到癌基因的活化和抑癌基因的失活，并存在缺失、易位、倒位等染色体畸变,2.体细胞突变的后果,83,84,（2）致畸胎：致突变物可透过胎盘作用于胚胎体细胞引起畸胎，所以致畸作用不完全是亲代生殖细胞突变的后果（3）其他不良后果：动脉粥样硬化、衰老,85,常染色体异常,Downsyndrome(trisomy21):先天愚型或唐氏综合征,86,Patausyndrome(trisomy13)帕陶氏综合征:seriouseye,brain,circulatorydefectsaswellascleftpalate.Childrenrarelylivemorethanafewmonths.,87,Edwardssyndrome(trisomy18)爱德华氏综合征:almosteveryorgansystemaffected.ChildrenwithfullTrisomy18generallydonotlivemorethanafewmonths.,88,性染色体不分离（X和Y染色体）,Klinefeltersyndrome:47,XXY克兰费尔特综合征males.Malesexorgans;unusuallysmalltestes,sterile.Breastenlargementandotherfemininebodycharacteristics.Normalintelligence.,89,47,XYYmales:Individualsaresomewhattallerthanaverageandoftenhavebelownormalintelligence.TrisomyX:47,XXXfemales.healthyandfertile-usuallycannotbedistinguishedfromnormalfemaleexceptbykaryotype,90,MonosomyX(Turnerssyndrome)特纳氏综合症:theonlyviablemonosomyinhumans-womenwithTurnershaveonly45chromosomes!XOindividualsaregeneticallyfemale,however,theydonotmaturesexuallyduringpubertyandaresterile.Shortstatureandnormalintelligence.(98%ofthesefetusesdiebeforebirth),91,染色体结构改变,Deletion:cryofthecatAspecificdeletionofasmallportionofchromosome5;thesechildrenhaveseverementalretardation,asmallheadwithunusualfacialfeatures,andacrythatsoundslikeadistressedcat.,92,Duplication:FragileX:themostcommonformofmentalretardation.TheXchromosomeofsomepeopleisunusuallyfragileatonetip-seenhangingbyathreadunderamicroscope.Mostpeoplehave29repeatsatthisendoftheirX-chromosome,thosewithFragileXhaveover700repeatsduetoduplications.Affects1:1500males,1:2500females.,93,Translocation:causedifficultiesineggorspermdevelopmentandnormaldevelopmentofazygote.AcuteMyelogenousLeukemiaiscausedbythistranslocation:,94,第四节机体对致突变作用的影响,95,DNA执行高保真的复制,修复DNA损伤,损伤耐受机制:是指DNA遗传可绕过那些阻止DNA复制的DNA损伤机制修复机制：直接修复和切除修复,遗传信息代代相传，并且高度保真,96,1.DNA损伤不仅可因外源性因素所致，也可因内源性因素所致2.不同类型DNA损伤通过不同的DNA修复途径修复,DNA损伤修复的一般特点,97,3.不同类型DNA损伤修复速度是不同的4.DNA损伤修复机制有些是基本的，有些是可诱导的5.DNA损伤修复功能存在物种和个体差异,98,一、DNA损伤的修复,1.光复活（photoreactivation)：修复紫外线损伤产生的胸腺嘧啶二聚体，广泛存在原核和真核生物体内2.“适应性”反应：主要是O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT)修复鸟嘌呤O6位的烷基化损伤,99,100,3.切除修复,切除修复分为：碱基切除修复（BER)：核苷酸切除修复（NER)：总基因组修复（GGR)；转录偶联修复（TCR)错配修复（mismatchrepair，MMR)：识别并切除错配的碱基对，如G:T和A:C,101,（1）识别：糖基化酶识别异常的碱基，随后使异常嘌呤的N-9位或异常嘧啶的N-3位与脱氧核糖之间的键发生水解，形成无嘌呤或嘧啶的位点（apurinic-apyrimidinicsite,AP位点）（2）AP内切酶将DNA链切断（3）DNA聚合酶合成DNA片段，填补空缺（4）DNA连接酶将新合成的补片接上,102,碱基切除修复,103,核苷酸切除修复,104,4.DNA双链断裂修复同源重组修复（homologyrecombination，HR)非同源末端连接(non-homologyendjoining，NHEJ)(实质上是耐受过程，易错。),105,（1）诱导性修复（2）修复过程有明显的错误（3）SOS系统为多基因控制,特点,5.呼救性修复（SOS修复）,一种能够引起误差修复的紧急呼救修复，是在无模板DNA情况下合成酶的诱导修复。正常情况下无活性有关酶系，DNA受损伤而复制又受到抑制情况下发出信号，激活有关酶系，对DNA损伤进行修复，其中DNA多聚酶起重要作用，在无模板情况下，进行DNA修复再合成，并将DNA片段插入受损DNA空隙处，其原则是：丧失某些信息而存活总比死亡好一些。,106,易错修复（error-pronerepair)：是指突变作为修复的结果或作为损伤旁路发生的DNA修复光复活、适应性修复和切除修复倾向于无误修复SOS修复就是易错修复，是DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生存率，但留下的错误较多，故又称为错误倾向修复（error-pronerepair），使细胞有较高的突变率。,107,108,DNA损伤、修复及后果,109,遗传毒物,终致突变物+DNA,解毒,加合物DNA损伤,修复,无错,易错修复,复制后修复,细胞死亡、静止状态的细胞,DNA复制,加合的碱基错配,损伤正在复制的DNA,突变,细胞存活,细胞存活,110,突变模式：DNA损伤-修复-突变,任何DNA损伤，只要修复无误，突变就不会发生，如果修复错误或未经修复，损伤就固定下来，于是发生突变,111,第五节观察化学毒物致突变作用的基本方法（致突变试验/遗传毒性试验）,112,检测外源化学物的致突变性(遗传毒性)，预测其对哺乳动物和人的潜在致癌性，以及其他不良效应。,致突变试验/遗传毒性试验的目的,113,一、观察项目的选择,1.观察效应终点（遗传学终点）的类型：（1）DNA碱基序列改变（基因突变）（2）染色体结构改变（染色体畸变）（3）染色体数目改变（非整倍体和多倍体）（4）DNA原始损伤、重组、交换等（致突变过程中发生的其他事件，间接反映致突变的可能性）,114,在实际工作中，没有一项致突变试验能涵盖所有的遗传学终点，故需用一组试验配套进行检测。最理想的试验组应包括每一类型的遗传学终点，如回复突变试验、微核试验、细菌DNA修复试验和体外姐妹染色单体交换试验（SCE)，这一组试验包括主要类型遗传学终点。,2.试验组合的原则,115,试验组应包括体内试验与体外试验（+S9和-S9），体细胞突变试验和生殖细胞突变试验,试验组中的指示生物应包括几个进化阶段，至少要包括原核细胞与真核细胞两个系统,116,例如：食品安全性毒理学评价明确要求“遗传毒性试验的组合必须考虑原核细胞和真核细胞、生殖细胞和体细胞、体内和体外试验相结合的原则”从Ames试验或V79/HGPRT基因突变试验、骨髓细胞微核试验或哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验、TK基因突变试验或“小鼠精子畸形分析或睾丸染色体畸变分析”中分别各选一项。P143,用何种方法组合来评价化学毒物，主要取决于具体样品测试所依据的国家标准或规范,117,二、常用的致突变试验,1.鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）原理：检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株(his-)回复突变成野生型(his+)的能力,118,组氨酸突变菌(his-)：在不含组氨酸的最低营养平皿上不能生长回复突变成野生型(his+)：可在不含组氨酸的最低营养平皿上生长,119,120,标准试验菌株有四种：TA97和TA98检测移码突变、TA100检测碱基置换突变、TA102对醛、过氧化物及DNA交联剂较敏感这四个试验菌株除了含有his-突变，还有一些附加突变，以提高敏感性,121,只要在一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物仅当四种试验菌株均得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物,结果判断,122,不加S9混合液得到阳性结果，说明受试物是直接致突变物加S9混合液才得到阳性结果，说明该受试物是间接致突变物,123,2.微核试验（micronucleustest，MNT),微核（micronucleus):是指染色体无着丝点断片或因纺锤体受损伤而丢失的整个染色体在细胞分裂的后期仍留在子细胞的胞质内，成为一个或几个规则的次核,124,125,正常细胞、微核细胞和核异常细胞,指示正常细胞；指示微核细胞；指示核异常细胞（2.5100）,126,常用啮齿类动物骨髓嗜多染红细胞(PCE)做微核试验PCE是红细胞成熟的一个阶段，此时红细胞的主核已排出，微核容易辩认，PCE胞质含RNA，染色与成熟红细胞易于区别，故为骨髓微核试验的首选细胞群,127,正常细胞、微核细胞,128,3、染色体畸变分析chromosomeaberrationassay,观察染色体形态结构和数目改变，又称细胞遗传学试验。将观察细胞停留在细胞分裂中期相，用显微镜检查染色体畸变和染色体分离异常。,129,4、显性致死试验Dominantlethaltest,显性致死突变指哺乳动物生殖细胞染色体发生结构和数目变化，出现的受精卵在着床前死亡和胚胎早期死亡。它是评价化学毒物对雄性动物的生殖细胞遗传毒性较好的方法之一。,130,5、果蝇伴性隐性致死试验Sex-linkedrecessivelethaltest,SLRL,利用隐性基因在伴性遗传中具有交叉遗传特征，选择黑腹果蝇，给雄蝇受试物，如雄蝇的X染色体有突变，传给F1代雌蝇，再通过F1代雌蝇传给F2代雄蝇，使位于X染色体上的隐性基因在半合型雄蝇表现出来。,131,132,一条染色体的两条单体在同一位置发生同源片段的变换，称为姐妹染色单体交换。由于交换是对等的，所以染色体的形状没有改变，但用特殊的培养液和处理方法可以显示出来,6、姐妹染色单体交换Sister-chromatidexchange,SCE,133,134,SCE的遗传学意义还不完全清楚，是否存在自发的SCE也还有争议，交换的机理尚未完全阐明，但它显然与DNA损伤和修复过程有关。作为一种简便和敏感的遗传学指标，它在诱变和肿瘤研究等领域中的应用十分广泛。例如，目前已知许多环境诱变剂、职业有害因素、抗肿瘤药物、病毒等都可以引起SCE率增加，Bloom综合征患者和某些肿瘤患者的SCE率也明显上升。,135,7、荧光原位杂交技术Fluorescenceinsituhybridization,FISH,利用荧光探针，将已标记或经特殊修饰的核酸探针与已固定的组织、细胞或染色体中DNA、RNA杂交，继而通过分析标记探针在被检对象中的显示状况而达到对特殊目标顺序进行检测、定位的目的。,136,AnexampleofFISH-treatedmetaphasechromosomeschromosomes1,2,and4werelabeledyellowwithFISHandtheotherchromosomeswerestainedred.Translocationsbetweenyellowandredchromosomesaredetected.Theleftpicturerepresentsanormalcellandtherightpictureisanexampleofreciprocaltranslocationwithtwobi-colorchromosomes(indicatedbytwoarrows).,137,8.单细胞凝胶电泳（singlecellgelelectrophoresis，SCGE),在单细胞水平上定量检测DNA损伤,138,原理：在电泳槽中，DNA断片在电场的作用下，由细胞核中移出，并向阳极泳动，经荧光染色后见到细胞核和移出的DNA断片，形成有如彗星一样的彗星头和彗星尾，故又称彗星试验（comettest),139,1.阴性、阳性对照的设立：阴性对照：即未处理对照或溶剂对照阳性对照：用某种已知能产生阳性反应的物质作对照,三、致突变试验中的一些问题,140,2.体外试验活化系统的采用许多化合物不具有致突变性，经哺乳动物代谢才转变成致突变物。由于微生物和培养的哺乳动物细胞缺乏整体动物体内的许多代谢能力。必须加入代谢活化系统以检出前致突变物。,141,（1）盲法观察（2）阴性对照和阳性对照的设立（3）资料的统计学分析（4）试验结果的重现性,3.致突变试验的质量控制措施,