染色体核型分析.ppt

染色体标本制备及核型分析,染色体核型分析,质量保障部Faye,一、名词解释二、染色体标本制备三、染色体核型分析,实验耗材前期处理实验步骤,玻片标本质量评价计数标准、合格指标染色体核型排列核型检测的可重复性,一、名词解释,核型分裂相,一个体细胞中的全部染色体，按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。小鼠：40，XY、40，XX人类：46，XY、46，XX,细胞分裂过程中每个时期的细胞形态特征，包括细胞的总体形状和遗传物质的变化。,一、名词解释,数量变异（性染色体丢失/增加、近端着丝粒染色体三体）,（中期）分裂相核型,结构变异（缺失、重复、倒位、易位）,二、染色体标本制备,实验耗材,仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、离心机、光学显微镜、刻度离心管、乳头吸管、棕色试剂瓶、载玻片、吹风机、玻片架、染色缸主要试剂：秋水仙素、低渗液、卡诺氏固定液、吉姆萨染液、胰酶、1NHCl、1NNaOH、MEF培养基、PBS,二、染色体标本制备,前期处理,样品要求：对数期生长，状态良好，紧密度高，折光性好，细胞量T25/60mm平皿差速贴壁法去除MEF（KSR培养体系除外）,终止培养前12小时，加入秋水仙素（100ug/ml），最终浓度为0.10.2ug/ml。,二、染色体标本制备,实验步骤,二、染色体标本制备,细胞收获,制片,固定,预固定,低渗处理,消化并收集细胞至离心管，吹打成单细胞悬液，250g，5min离心，弃上清,实验步骤,二、染色体标本制备,细胞收获,制片,固定,预固定,低渗处理,加入37预热的低渗液（0.075mol/L）5ml，吹打至均匀，37水浴15-20min。,实验步骤,二、染色体标本制备,细胞收获,制片,固定,预固定,低渗处理,加入37预热的低渗液（0.075mol/L）5ml，吹打至均匀，37水浴15-20min。,实验步骤,配制：0.075mol/LKCl溶液作用：低渗作用因素：时间、温度、浓度,二、染色体标本制备,细胞收获,制片,固定,预固定,低渗处理,实验步骤,离心弃上清，将细胞沉淀震荡悬浮或气泡吹打法轻柔地重悬细胞。沿管壁缓慢加入固定液0.5-1.0mL，边滴加边震荡均匀，静置5min后离心弃上清。,二、染色体标本制备,细胞收获,制片,固定,预固定,低渗处理,实验步骤,离心弃上清，将细胞沉淀震荡悬浮或气泡吹打法轻柔地重悬细胞。沿管壁缓慢加入固定液0.5-1.0mL，边滴加边震荡均匀，静置5min后离心弃上清。,配制：甲醇：冰乙酸=3：1，现用现配。作用：固定并维持染色体结构的完整性防护：甲醇毒性，冰乙酸刺激性和腐蚀性,二、染色体标本制备,细胞收获,制片,固定,预固定,低渗处理,实验步骤,（1）加入3ml固定液，静置30min，离心弃上清；（2）再次加入3ml固定液，吹打均匀并静置30min,二、染色体标本制备,细胞收获,制片,固定,预固定,低渗处理,实验步骤,离心弃上清液，根据细胞数量情况，加入12mL固定液，吹打细胞制成悬液，悬液呈微白色时为最佳。,二、染色体标本制备,细胞收获,制片,固定,预固定,低渗处理,实验内容,用滴管吸取细胞悬液，高空滴在冰冻玻片上，立即在酒精灯的火焰下过火几次，置80烤箱中烤片2h。,二、染色体标本制备,细胞收获,制片,固定,预固定,低渗处理,实验步骤,用滴管吸取细胞悬液，高空滴在冰冻玻片上，立即在酒精灯的火焰下过火几次，置80烤箱中烤片2h。,要求：洁净、冰冻处理：逐片清洗（洗洁精超声波自来水纯水），95%乙醇浸泡24h，纯水逐片刷洗，放置于装有纯水的器皿中，4保存。,二、染色体标本制备,细胞收获,制片,固定,预固定,低渗处理,实验步骤,预热胰蛋白酶消化25-30s，Giemsa染色10min。清水冲洗染液，用吹风机吹干。,二、染色体标本制备,细胞收获,制片,固定,预固定,低渗处理,实验步骤,预热胰蛋白酶消化25-30s，Giemsa染色10min。清水冲洗染液，用吹风机吹干。,要求：0.25%，pH6.87.2作用：去除染色体上的蛋白质，便于染色。,配制：Giemsa原液：磷酸缓冲液（pH7.4）=1：9，现用现配。,三、染色体核型分析,玻片标本质量评价,玻片颜色,蓝紫色玫红色着色浅,解决方案,配制新的染液；适当提高胰酶消化玻片的时间。,三、染色体核型分析,玻片标本质量评价,细胞密度,过密适中过稀,解决方案,制备玻片时，对每一个样品都先进行试片，并在镜下观察细胞密度，从而调整悬液密度。,三、染色体核型分析,玻片标本质量评价,分裂相密度,足够稀少,解决方案,适当提高固定液中冰醋酸比例；制备较多的玻片,三、染色体核型分析,玻片标本质量评价,分裂相形态-紧密度,过密适中过散,解决方案,过密：适当提高固定液中冰醋酸比例；过散：适当降低固定液中冰醋酸比例。,三、染色体核型分析,玻片标本质量评价,分裂相形态,过密适中过散,解决方案,过密：适当提高固定液中冰醋酸比例，增加滴片高度；过散：适当降低固定液中冰醋酸比例，减小滴片高度。,三、染色体核型分析,玻片标本质量评价,分裂相形态,解决方案,尽量将细胞吹打成单细胞悬液；滴片时勿重复滴加同一区域。,重叠,三、染色体核型分析,玻片标本质量评价,染色体形态,适中短小过长扭曲交联消化过度,三、染色体核型分析,计数标准合格指标,分裂相需完整独立，染色体不过于松散，周围无其他距离很近的分裂相。染色体形态适中，不过度短小或纤长，染色体彼此间无交联缠绕或者交联的染色体能明确的区分。染色体G显带普遍较清晰，质检人员能够精确的判断核型位置。计数30个分裂相，正常比例50%数量是否异常暂不涉及核型排列结构是否异常,三、染色体核型分析,染色体核型排列,三、染色体核型分析,染色体核型排列,三、染色体核型分析,染色体核型排列,三、染色体核型分析,染色体核型排列,正常：46，XY,大Y：46，XY，Y18,小Y：46，XY，YG组,三、染色体核型分析,核型检测的可重复性,染色体标本制备及核型分析,