微生物检验常规培养基的制作.ppt

常规培养基的制作,第一节基本理论,培养基的定义：培养基是按照微生物生长繁殖或积累代谢产物所需要的各种营养物质，由人工配制而成的营养基质，它专供微生物培养、分离、鉴别、研究和保存用。培养基的用途：主要用于繁殖及分离纯化细菌、传代和保存菌种、鉴别细菌种属、研究细菌生理及生化特性、制造菌苗、疫苗和其他微生物制剂等。,培养基的分类,1.按用途分类：基础培养基、营养培养基、增菌培养基、选择性培养基、鉴别培养基、显色培养基,基础培养基含细菌所需最基本营养成分，可供大多数细菌生长。常用的如含适量蛋白胨、氯化钠、磷酸盐，pH7.2-7.6的营养肉汤和营养琼脂。营养培养基基础培养基再加入一些其他营养成分，如葡萄糖、血液、血清、酵母浸膏、生长因子等，以满足营养要求较高的细菌生长繁殖所需要的营养。,增菌培养基多为液体培养基，主要目的是增加标本中目的菌数量，以提高目的菌检出率。选择性培养基在培养基中加入抑制物质，使之具有选择性，有利于目的菌检出和识别，而抑制其他非目的菌生长或者使其生长不佳。,加入青霉素的培养基：分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基：分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基：分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基：分离自养型微生物加入氨基嘌呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基：分离杂交瘤细胞,鉴别培养基利用各种细菌分解糖类和蛋白质的能力及其代谢产物的不同，即生化反应能力不同，在培养基中加入特定的作用底物和指示剂，以此来区别各种细菌。主要用于检查各种细菌的生化反应。如伊红美蓝培养基可鉴别大肠杆菌，其代谢产物有机酸与伊红美蓝结合，使菌落呈现绿色金属,大肠杆菌EMB平板,沙门氏菌BS琼脂,沙门氏菌XLD琼脂,显色培养基细菌在生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性酶，按酶的特性，选用相应底物和指示剂，将其配制在相关培养基中。根据细菌反应后出现的菌落颜色变化，确定待分离可疑菌株，有助于细菌快速诊断。,副溶血性弧菌,副溶API20E,2.按物理性状分类,液体培养基流体培养基半固体培养基固体培养基,液体培养基:不含凝固剂，利于菌体的快速繁殖、代谢和积累产物流体培养基:含0.05-0.07%琼脂粉，可降低空气中氧进入培养基的速度，利于一般厌氧菌的生长繁殖半固体培养基:含0.2-0.8%琼脂粉，多用于细菌的动力观察、菌种传代保存及贮运细菌标本材料；固体培养基:含1.5-2%琼脂，用于细菌的分离、鉴定、菌种保存及细菌疫苗制备等多方面,液体培养基,固体培养基,半固体培养基,液体培养基：主要用于工业生产；固体培养基：主要用于分离、鉴定等；半固体培养基：主要用于观察、保藏菌种。,3.按成分分类,合成培养基由化学物质和成分已知的各种物质所组成，可以是无机盐和有机物质等。天然培养基由化学物质不完全清楚或各批物质很难一致的天然物质所组成，如蛋白胨、牛肉膏、血液、马铃薯等。半合成培养基由不明化学成分的天然物质和已知化学成分的物质组成,天然培养基化学成分不明确，主要用于工业生产；合成培养基化学成分明确，主要用于分类、鉴定。,天然培养基：优点：取材便利、营养丰富、配制简便；缺点：营养成分难以控制、实验结果的重复性较差。天然培养基如培养细菌的牛肉膏蛋白胨培养基；血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。,合成培养基:优点：化学成分及其含量明确、实验的可重复性好；缺点：配制繁琐、成本较高。,培养基的主要成分及其作用,（1）营养物质：细菌在生长繁殖过程中所需要的营养成分，因细菌种类不同而异，有的对营养要求不高，仅需碳源、氮源即可；有的则要求较高，除碳源、氮源外，还需要鸡蛋、血清、血液等。主要有蛋白胨、牛肉浸液、牛肉浸膏、糖醇类、血液、鸡蛋和动物血清、生长因子、无机盐类等。,1）蛋白胨：蛋白胨是培养基中作为氮源应用最广泛的基本成分，它用于合成菌体蛋白质、酶类以及细菌生长繁殖。其特点是易溶于水，吸水性强，故须干燥密封保存。此外，蛋白胨受高热不凝固，遇酸不沉淀，在培养基中具缓冲作用，并含有各种游离氨基酸，易被细菌所利用。,蛋白胨是动物或植物蛋白质经酶或酸碱分解而产生的中间产物。蛋白质消化越彻底，含氨基酸越多，越有利于细菌生长繁殖。由于蛋白质来源不同，消化程度不同，制成的胨质量相差很大。通常的商品蛋白胨是由胃蛋白酶消化蛋白质而制成的含胨、多肽及多种氨基酸的混合物，可供大多数细菌生长需要。其缺点是含某些氨基酸较少。胰蛋白胨是胰蛋白酶在碱性条件下消化蛋白质所获得的分解产物，其中含有很多氨基酸和多肽，特别是富含色氨酸，更适合作靛基质试验用的蛋白胨水。,2）牛肉浸液,牛肉浸液是将新鲜不含脂肪、肌膜、肌腱等精牛肉浸泡煮沸制成的肉汁。包括两类浸出物。一类为含氮可溶性浸出物（如肌酸、尿酸、腺苷酸、黄嘌呤、核苷酸、尿素、谷氨酸、肌肽等），另一类为非含氮浸出物质（如肝糖、磷酸己糖、乳糖、琥珀酸、肌醇、脂肪与无机盐等）。牛肉浸液可作为细菌氮源和碳源，但因含氮物质较少，尚不能满足细菌生长需要。,3）牛肉浸膏,为牛肉浸液经长时间加热，蒸发掉水分后浓缩而成的膏状制品。牛肉浸液中的不耐热物质如糖类等已被破坏，因而其营养价值不如肉浸液，但其因不含糖和使用方便，故可作肠道细菌鉴别培养基基础成分。,4）糖、醇类,糖类是细菌生长繁殖所需的碳源、能源的基本成分。最常用的单糖是葡萄糖、阿拉伯糖等；双糖是乳糖、蔗糖等；多糖有菊糖和淀粉；醇类有甘露醇、卫矛醇等。其他的糖类和醇类主要用于发酵反应以及鉴定细菌。糖不耐热，过久的高热会被破坏，在碱性及与氮源一起高温情况下，破坏更快，制备这类培养基时，通常不用高温，并与培养基中其他成分分别灭菌。,5）血液,培养基中加入血液，可增加蛋白质、多种氨基酸、糖类、无机盐等营养成分，同时还能提供辅酶、血红素等特殊生长因子，供某些对营养要求高的细菌生长繁殖之用。此外，含血液的培养基还可以用于观察细菌溶血反应，作为细菌鉴定的一项指标。,血平板溶血现象,6）鸡蛋和动物血清,鸡蛋和动物血清对一部分细菌来说是必须营养成分，可作为养料直接被细菌利用。常用于制备特殊培养基，如培养结核杆菌的罗氏培养基和白喉棒状杆菌的吕氏血清培养基等。此外鸡蛋和血清还具有凝固剂作用，便于观察细菌菌落形态和生长情况。,7）生长因子,在细菌生长繁殖过程中，需要一定的辅助生长因子。生长因子根据化学结构及代谢功能不同分为三大类：维生素、氨基酸和嘌呤与嘧啶。细菌对这些物质需要量不大，但如缺少，某些细菌就不能生长。通常肝浸液、肉浸液、酵母浸液和血液中含有大部分生长因子，但有时需要另外加入。,8）无机盐类,制备培养基时常加入氯化钠和磷酸盐，这是因为细菌生长繁殖需要无机盐类，如K、Na、Mg、Fe、磷酸盐、氯化物等。其中，有的需要量极微，如Mn、Cu等。这些无机离子除作为构成菌体的成分外，还是酶的激活剂，并起维持一定渗透压的作用。,（2）水分,细菌细胞75%-80%由水组成。水是细菌营养、代谢过程中不可缺少的物质；水又是良好的溶剂，培养基中许多营养物质均需溶于水才能被细菌吸收。蒸馏水和离子交换水不含杂质，在制备培养基时，一般需使用蒸馏水和离子交换水。无蒸馏水可以用自来水代替，因其中含有某些微量元素，有利于细菌生长，但应先煮沸使部分盐类沉淀，过滤澄清后再使用。,（3）凝固物质,配制固体培养基的凝固物质有琼脂、明胶和蛋白、血清等，最常用琼脂，特殊目的也可用明胶等。琼脂是从石花菜等海藻中提取出来的一种胶状物质，属多糖类，一般不被细菌分解利用，无营养价值。琼脂在98摄氏度以上融化，在低于45摄氏度时则凝固成胶冻状态。用途不同的培养基中琼脂含量不同，固体培养基含量为2%-2.5%，半固体培养基琼脂含量为0.3%-0.5%。,（4）抑制剂和指示剂,抑制剂和指示剂是由于选择、鉴定和判断结果的需要而加入到培养基中的物质，并不为细菌生长繁殖所需。抑制剂加入目的是抑制非检出菌生长或其少生长，以利于检出菌生长。根据所要抑制选择不同抑制剂。常用抑制剂有胆盐、煌绿、玫瑰红酸、亚硫酸钠、四硫磺酸盐、叠氮钠及一些染料和某些抗生素等。在选择抑制剂时需注意抑制剂应具有选择性抑制作用。,指示剂是为方便了解和观察细菌是否利用和分解培养基中糖、醇类物质，而在培养基中加入的成分。常用指示剂多为酸碱指示剂，如酚红、溴甲酚紫、溴麝香草酚蓝、中性红、甲基红、碱性复红等，还有氧化还原指示剂，如亚甲蓝。此外，一些新的氧化还原指示剂如四氮唑盐类等，也已广泛用于细菌快速培养和鉴定以及快速药敏试验方面。,培养基配制原则：,（1）目的要明确：根据微生物的种类、培养目的等确定配制培养基的种类，因为不同的微生物对培养物质的需求不同。（2）营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。（3）pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同。细菌pH为：6.5-7.5；放线菌pH为：7.5-8.5；真菌pH为：5.0-6.0。,第二节实验内容,一、实验目的,掌握在真菌、细菌、放线菌分离培养工作中常用的合成和半合成培养基配制的一般原理、方法、程序、环节及要求和注意事项。,二、实验原理,培养基的配制是进行微生物学实验工作的重要基础。由于微生物种类及代谢类型的多样性，因而用于培养微生物培养基的种类也很多，它们的配方组成及配制方法虽各有差异,但一般培养基配制的常规程序却大致相同，例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节。,肉膏蛋白胨培养基是一种广泛用于培养细菌的培养基，属于半合成培养基。其主要成分是牛肉膏、蛋白胨和NaCl。它们分别提供微生物生长繁殖所需要的碳源、氮源、能源、生长因子和无机盐等。培养基都是水溶液，这是因为一切生物细胞都必须要有水的参与。,高氏一号培养基是一种用于培养放线菌的合成培养基。培养基中的可溶性淀粉作为碳源和能源，KNO3作为氮源，K2HPO4、MgSO4和FeSO4作为无机盐等。,马铃薯葡萄糖培养基被广泛用于培养酵母菌和霉菌，为半合成培养基。食品检测国标使用虎红培养基。,1.培养基的配制过程,1.1液体培养基的配制1.1.1称量一般可用1/100粗天平称量配制培养基所需的各种药品。先按培养基配方计算各成分的用量然后进行准确称量。染料、指示剂、胆盐等物质何时加入？调整pH后。1.1.2溶化将称好的药品置于一烧杯中，先加入少量水，然后加热溶解，并不断用玻璃棒搅动。含铜大于0.3mol/L时，细菌不易生长；含铁大于0.14mol/L妨碍细菌产生毒素。,1.1.3定容,待全部药品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需体积。问：如某种药品用量太少如何称量？答：可先配置成较浓溶液，然后按比例吸收一定体积溶液，加入到培养基中。,1.1.4调PH,一般用pH试纸测定培养基pH。用剪刀剪出一段pH纸，然后用镊子夹取此段pH试纸，在培养基中蘸一下，观察其pH范围，如培养基偏酸或偏碱时，可用1mol/LNaOH或1mol/LHCl溶液进行调节。调节pH时，应逐渐加入NaOH或HCl溶液，防止局部过酸或过碱，破坏培养基中成分。边加边搅拌，并不时用pH试纸测试，直至达到所需pH为止。,注：一般将培养基pH调整高出所需值的0.1-0.2个pH单位，经高压灭菌后，其pH要降低0.1-0.2个单位。,1.1.5过滤,用滤纸或多层纱布过滤培养基。一般无特殊要求时，此步可省去。,1.2固体培养基的配制,配制固体培养基时，应将已配好的液体培养基加热煮沸，再将称好的琼脂加入，并用玻棒不断搅拌，以免糊底烧焦。继续加热至琼脂全部融化，最后补足因蒸发而失去的水分。,2.培养基的分装,根据不同需要，可将已配好的培养基分装入试管或锥形瓶内，分装时注意不要使培养基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培养基沾污管口或瓶口时，可用镊子夹一小块脱脂棉，擦去管口或瓶口的培养基，并将脱脂棉弃去。,2.1试管的分装,取一个玻璃漏斗，装在铁架上，漏斗下连一根橡皮管，橡皮管下端再与玻璃管相接，橡皮管的中部加一弹簧夹。分装时，用左手拿住空试管中部，并将漏斗下的玻璃管嘴插入试管内，以右手拇指及食指开放弹簧夹，中指及无名指夹住玻璃嘴，使培养基直接流入试管内。注：分装在不同规格三角烧瓶、试管等容器中，分装量不宜超过容器的2/3，否则会溢出。,装入试管培养基的量，视试管大小及需要而定。若所用试管大小为15*150mm时，液体培养基可分装至试管高度1/4左右为宜；如分装固体或半固体培养基时，琼脂完全融化后，应趁热分装于试管中。用于制作斜面的固体培养基的分装量为管高1/5，半固体培养基分装量为管高的1/3为宜。,2.2锥形瓶的分装,用于振荡培养微生物时，可在250ml锥形瓶中加入50ml的液体培养基；若用于制作平板培养基时，可在250ml锥形瓶中加入150ml培养基，然后再加入3g琼脂粉（按2%计算）。灭菌时瓶中琼脂粉同时被融化。,3.棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎,为了培养好氧性微生物，需提供优良通气条件，同时为防止杂菌污染，则必须对通入试管或锥形瓶内空气先进行过滤，除菌。通常方法是在试管及锥形瓶口加上棉花塞等。,3.1试管棉塞的制作,制棉塞时，应选取用大小，厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成的圆孔中，用右手食指将棉花从中央压入圆孔中制成棉塞，然后直接压入试管或锥形瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折叠法制作棉塞。制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入，棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，试管不下落为准。棉塞的2/3在试管内，1/3在试管外。,将装好培养基并塞好棉塞或盖好管帽的试管捆成一捆，外面包上一层牛皮纸。用铅笔注明培养基名称及配制日期。灭菌待用。,3.2锥形瓶棉塞制作,通常在棉塞外包上一层纱布，再塞在瓶口上。有时为了进行液体振荡培养加大通气量，则可用8层纱布代替棉塞包在瓶口上。在装好培养基并塞好棉塞或包上8层纱布或盖好培养容器封口膜的锥形瓶口上，再包上一层牛皮纸并用线捆好，灭菌待用。,4.培养基的灭菌,下一章节详述。,5.斜面和平板的制作,5.1斜面的制作将已灭菌装有琼脂培养基的试管，趁热倾斜固定，凝固后即成斜面。斜面长度不超过试管长度1/2为宜。如制作半固体或固体深层培养基时，灭菌后则应垂直放置至冷凝。,葡萄糖：乳糖1：9下黄上不黄为分解葡萄糖，不分解乳糖上下均黄为分解葡萄糖、乳糖上下均不黄为非发酵菌中间变为黑色为产H2S,5.2平板的制作,将装在锥形瓶或试管中已灭菌的琼脂培养基融化后，冷却至50摄氏度左右倾入无菌培养皿中。温度过高时，皿盖上冷凝水太多，温度低于50摄氏度，培养基易于凝固而无法制作平板。平板的制作应在酒精灯旁进行，左手拿培养皿，右手拿锥形瓶的底部或试管，左手同时用小指和手掌将棉塞打开，灼瓶口。用左手大拇指将培养皿盖打开一缝。置于桌上，轻轻旋转平皿。使培养基均匀分布于整个平皿中，冷凝后即成平板。,三、实验材料,3.1药品牛肉膏、蛋白胨、NaCl、酵母膏、可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4、MgSO47H2O和FeSO47H2O、马铃薯、葡萄糖、琼脂等。,3.2溶液,1mol/LNaOH、1mol/LHCl。,3.3仪器,天平、高压蒸汽灭菌器。,3.4玻璃器皿,移液管、试管、量筒、锥形瓶、培养皿、玻璃漏斗等。,3.5其他常用器皿,药匙、pH试纸、称量纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管盖、牛皮纸、报纸等。,四、实验内容,4.1肉膏蛋白胨培养基的配制4.1.1培养基成分牛肉膏5g蛋白胨10gNaCl5g琼脂15-20g水1000mlPh7.2,4.1.2配制方法,（1）称量及融化分别称取蛋白胨和NaCl的所需量，置于烧杯中，加入所需水量的2/3左右的蒸馏水，用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一烧杯中，进行称量。然后加入少量蒸馏水于小烧杯中，加热融化。倒入上述烧杯中。将烧杯置于石棉网上加热，用玻璃棒搅拌，使药品全部融化。,（2）调Ph待溶液冷却至室温时，用1mol/lNaOH溶液调pH至7.2。（3）定容将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。（4）加琼脂加入所需量的琼脂，加热融化，补充失水。（5）分装、加塞、包扎。（6）高压蒸汽灭菌0.1MPa灭菌20min。,4.2高氏合成一号培养基4.3马铃薯葡萄糖培养基,4.4干粉培养基使用注意事项,培养基摇匀后准确称量；使用蒸馏水或去离子水配制培养基；宜用中性玻璃质容器，不宜用铜或铁质容器；加热溶解时应适当搅拌，培养基不能过度加热；含琼脂的培养基高压灭菌后不能长时间处于高温状态，应适当水浴及时使用或迅速冷却保存。,五、实验报告内容,5.1记录所配制的培养基的名称及成分。5.2分析你配制培养基的碳源、氮源、能源、无机盐及维生素的来源。,六、思考题,6.1培养细菌一般常用什么培养基？培养放线菌常用什么培养基？培养酵母和霉菌常用什么培养基？现行国家标准培养基。6.2牛肉膏应置于何种容器中称量为宜？6.3何谓培养基的自然pH？为什么在配制培养基时经常需要调节pH？,第三节玻璃器皿的包扎,1.培养皿的包扎培养皿常用牛皮纸或旧报纸包紧，一般以5-8套培养皿包成1包。包好后干热或湿热灭菌。或者不用纸包扎，直接放入特制的金属（不锈钢或铁皮）筒内，加盖干热灭菌。,2.吸管的包扎在干燥吸管的上端约0.5cm处，塞入一小段1-1.5cm的棉花，目的是避免将外界或嘴中杂菌吹入罐内，或不慎将菌液吸出馆外。棉花松紧要合适，若过紧，吹吸液体太费力；过松，吹气时棉花则会下滑。,挑取4-5cm宽的长纸条，将吸管尖端斜放在纸条的一端，与纸约呈30度角，折叠纸条包住尖端，左手握住吸管身，右手将吸管压紧，在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎。上端多余的纸条打一小结。包好的多支吸管可再用一张大报纸包成一捆灭菌。干热灭菌时，吸管可不用报纸包扎，直接放入不锈钢筒内，只需尖端朝筒底。,3.试管和三角瓶的包扎试管塞上棉花塞，三角瓶塞上棉花塞或“通气式”纱布塞（用8层纱布代替棉花制成的塞子），目的是提供通气条件和防止杂菌污染，外用牛皮纸或2层旧报纸与细线扎好。试管可以多支扎成一捆灭菌。,谢谢！,