Candidarugosalipase的表现及特性分析.ppt

Candidarugosalipase的表現及特性分析PDBID:1CRL,林柏宏11月26日,Introduction,Candidarugosa所產生的五種菌体外脂肪酶(LIP-1LIP-5)，皆為534個胺基酸，且在序列上具有高度的相似性，但卻有不同的基質特異性，由此可知CRL的序列與結構及基質特異性的相關性可能是非常嚴謹的。,脂肪酶的生化特性,A、催化之反應酯解反應(EsterHydrolysis)酯化反應(EsterSynthesis)內酯化作用(Intererterification)B、水解催化的特異性非特異性脂肪酶(non-specificlipase)1,3-特異性的脂肪酶(1,3-specificlipase)2-特異性脂肪酶(2-specificlipase)醯基特異性脂肪酶(Acylgroupspecificlipasereaction)C、催化機制醯化反應(acylation)去醯化反應(deacylation),脂肪酶的結構特性,/水解酵素摺疊構形(/hydrolasefolding)催化三元体(catalytictriad)為S209，H449，E341含氧陰離子洞(Oxyanionhole)為G124，A210頂蓋(Liddomain)位置6292AA,1CRL,-helix(red)and-sheet(yellow),Lid(green)、氧陰離子洞(orange)、催化三元体(purple),(A)Closed(inactive)form，黑色部分為胺基酸的位置6292所形成的頂蓋(Liddomain)。(B)Open(active)form，黑色部分為胺基酸的位置6292所形成的頂蓋(Liddomain)。,(A),(B),Wecananalyze,可以改變liddomain對受質的特異性以及活性有顯著的影響。將LIP的tunel部分的胺基酸突變後，以不同的triacylglycerides來觀測基質特異性的差異。LIP的序列以基因重組的方法，產生新式脂肪酶跟原本比較之間的差異，看看是否能提高熱穩定性和活性。各個脂肪酶胺基酸序列相同度的比較。,相似的程度,Lid,結晶結構發現脂肪中的頂蓋部位(liddomain)胺基酸序列差異頗大，因此以LIP4(19)/lid1，lid2，lid3與lid5分別轉型入P.pastoris系統，並將得到的脂肪進行酵素動力學以及活性測試，結果發現改變lid部位對脂肪的受質特異性以及活性都有顯著的影響。如在置換為lid2時，對triolein的活性可增至wildtype的5倍，而置換為lid5時，則為wildtype的2倍。但在lid1及lid3中則無明顯增加。同時在esterase活性中，只有lid2的活性提升，lid1，lid3及lid5的活性皆下降，由此證明lid部位對C.rugosa脂肪的功能，具有顯著的影響。,Lip1的Lid,CRL的Lid兩種結構open為紫色closed為藍色,有於Liddomain有hydrophobicmoment而又以LIP4最高，所以Lid在LIP的interfacialactivation過程扮演重要角色所以置換不同的Lid會呈現不同的物理性質，如蛋白質的表面的淨電荷和疏水性從模擬結構中可以看到活化能高低以及鄰近區的靜電力作用力，會決定該LIP的活化速率,可以看到Lid以帶正電的Lys75與蛋白質表面帶負電的Asp292形成氫鍵及靜電力。此作用使Lid維持打開的狀態，進而穩定open的結構,而Lid2上帶電荷殘基分布與Lid4相似。所以酵素動力學特性跟Lip4相近。,以下置換Lid1、Lid3、Lid5由於帶電荷殘基的分佈情形與Lid4不同。可以看到Lys75與Asp292的靜電引力受到Glu71的干擾，因此呈現較差的催化的效率。,以上的電腦分析的結果，發現了幾各與LIP活化過程相關的重要胺基酸。所以可以提供以後做site-directedmutagenesis的實驗，可以進步了解LIP的結構與功能間的關係。,