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11December2019,1,第三章酶的分离纯化,概述第一节起始材料的选择第二节细胞破碎第三节酶的提取第四节分离方法第五节酶纯化步骤的设计及纯化效果的定量评价复习题,11December2019,2,分离方法分述,一、离心分离法二、过滤与膜分离三、沉淀分离法四、层析分离法五、电泳分离法六、酶的结晶七、浓缩与干燥,11December2019,3,四、层析分离法,原理：利用混合物中各组分理化性质的差别，使各组分不同程度地分布在固定相和流动相中，当流动相经过固定相时，各组分随流动相移动速度不同，从而达到分离各组分的目的。吸附层析：利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合物中的各组分分离的方法。离子交换层析：依据被分离物质与分离介质间异种电荷的静电引力的不同来进行物质分离的。凝胶过滤层析：也称分子筛层析、凝胶过滤、排阻层析。是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量不同而进行分离的技术。亲和层析：利用生物分子对之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化的技术。,11December2019,4,（一）吸附层析法,1、概念吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合物中的各组分分离的方法。图2、吸附剂硅藻土、氧化铝、磷酸钙、羟基磷灰石和活性炭等。例一般在低pH值、低离子强度的条件下对酶进行吸附，而在提高pH值和增加离子强度的条件下，酶可解吸洗脱出来。3、吸附层析方法吸附剂可装在吸附柱上进行吸附柱层析；把吸附剂加到酶液中，吸附后过滤出来，再加洗脱剂，使酶解吸而洗脱出来。4、特点与应用设备简单，操作容易，吸附剂来源丰富，价格低廉，又具有的一定的分辨率，是层析中应用最早，而且至今仍广泛应用的层析分离技术。,枯草杆菌-淀粉酶在弱酸性条件下，可吸附在氧化铝上，再用pH89的Na3PO3溶液洗脱；中性蛋白酶可在pH6.58.5条件下，用硅藻土吸附，再在pH911.5的2%氯化钠溶液中洗脱出来。,11December2019,5,吸附层析法图,11December2019,6,（二）离子交换层析,1、原理：依据被分离物质与分离介质间异种电荷的静电引力的不同来进行物质分离。2、离子交换剂的构成：基质、功能基团（电荷基团）、反离子。羧甲基纤维素（CM-纤维素）：纤维素-O-CH2-COO-Na反离子基质电荷基团3、离子交换剂的种类4、离子交换剂的选择5、离子交换层析的操作流程6、离子交换层析的应用：制备纯化生命物质：活性可保存、分辨率高、测定蛋白质的等电点。,11December2019,7,离子交换原理图,11December2019,8,3、离子交换剂的种类,基质,电荷基团,疏水性：人工合成的与水结合力较小的树脂类物质，分离小分子物质。大孔树脂可用于酶。（离子交换树脂）,亲水性：天然或人工合成的与水结合力较大的物质。（离子交换纤维素、离子交换凝胶）,阳离子交换剂：电荷基团为（-），反离子为（+），与溶液中的阳离子交换，分为强型和弱型,阴离子交换剂：电荷基团为（+），反离子为（-），与溶液中的阴离子交换，也分为强型和弱型,常用的离子交换介（基）质离子交换剂保存剂,11December2019,9,亲水性离子交换剂,离子交换纤维素是以纤维素为母体引入活性基团而制成，亲水性能好，活性基团分布在纤维素表面，交换容量较大，是目前在酶的分离纯化方面广泛应用的离子交换剂。常用的有DEAE-纤维素、AE-纤维素、CMC（羧甲基纤维素）等。离子交换凝胶是以葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等为母体引入若干活性基团制成。这种离子交换剂同时具有离子交换和分子筛的作用，交换容量大，分辨能力强，在酶的分离纯化方面具有广阔的应用前景。常用的有DEAE葡聚糖凝胶、DEAE聚丙烯酰胺凝胶、DEAE琼脂糖凝胶、CM凝胶、SE（磺酸乙基）葡聚糖凝胶、SP（磺酸丙基）葡聚糖凝胶等。,11December2019,10,常用离子交换介质,11December2019,11,离子交换剂保存剂,11December2019,12,4、离子交换剂的选择,强弱离子交换剂的选择：强型：适用范围广，无离子水中或极端pH条件下稳定。弱型：适用范围窄，适合分离生物大分子物质。酶蛋白的pI为6-9时，考虑用强型离子交换剂。基质的选择：分离有活性的生物大分子物质时，亲水性好于疏水性。,离子交换剂类型的选择：考虑酶的稳定性酶在pHpI的条件下稳定，酶带正电，用阳离子交换剂；酶在pHpI的条件下稳定，酶带负电，用阴离子交换剂；在两种条件下都稳定时，二种交换剂都可应用。,11December2019,13,5、离子交换层析操作流程,离子交换剂可装成离子交换柱进行柱层析；可将离子交换剂加到酶液中，待交换后，将离子交换剂过滤分离出来，再用洗脱剂将酶洗脱出来。离子交换柱层析主要操作过程：（1）离子交换剂的处理与装柱（2）上柱（3）洗脱和收集（4）离子交换剂的再生,11December2019,14,（1）离子交换剂的处理与装柱,预处理：浸泡与脱气将干燥的离子交换剂用水浸泡2h以上，充分吸水膨胀后，减压抽除气泡，倾去水，用无离子水洗至澄清。再先后用4倍体积左右的2mol/L盐酸和2mol/L氢氧化钠浸泡各4h，再用无离子水洗至中性。转型经上述处理后的离子交换剂需经转型，使离子交换剂所带的可交换离子转变为适当的离子型。如阳离子交换剂用NaOH处理，转为Na+型；用HCl处理，转为H+型。阴离子交换剂用NaOH处理成OH-型；用HCl处理成Cl-型等。交换剂在使用后也需经转型，使之得以再生以重复使用。装柱转型后的离子交换剂小心地装进交换柱。装柱的好坏对分离效果有影响，要求装填得均匀，无气泡，无裂纹。装好后，保持液面在交换剂平面以上，防止空气进入。,11December2019,15,（2）上柱,样品液的控制：上柱时要注意酶液的pH值、温度和离子强度等条件。上柱：打开离子交换柱出口阀，让柱内液体慢慢流出。当液面刚好到达交换剂表面时，小心加进酶液，使酶液尽快均匀地分布于交换剂全表面，然后均匀进入交换剂层进行离子交换。继续加入酶液，直至交换剂的交换容量饱和为止。流速的控制：要控制好流速。流速太快，分离效果不好；流速太慢，则影响分离速度。有时由于离子交换剂颗粒太细，或柱较高，或酶液浓度、粘度较高等原因引起流速太慢时，为加快离子交换层析速度，可采用在柱进口适当加压或在出口适当减压的方法。,11December2019,16,（3）洗脱和收集,洗未吸附物上柱完毕后，先用水或缓冲液流过层析柱，使未吸附的物质洗出。洗脱目标物用适当的洗脱液，将吸附在离子交换剂上的离子按亲和力自小至大的顺序逐次洗脱下来，分别收集，以达到分离目的。若酶液组分很复杂，用一种洗脱液还达不到良好的分离效果。为此，可采用连续或阶梯式的梯度洗脱法。即采用按一定规律改变pH值（pH值梯度）或盐浓度（浓度梯度）的洗脱液进行洗脱。连续梯度洗脱液可按预先设计的梯度范围，在梯度混合器中配置。而阶梯式梯度洗脱液则分别配置几种不同pH值或不同盐浓度的缓冲液，使用时按设计好次序依次洗脱。,11December2019,17,（4）离子交换剂的再生,洗脱收集完毕后，为使离子交换剂再次使用，需要经过再生处理。含杂质较少时，再生只要用酸、碱或盐进行转型即可；含杂质较多的情况下，再生时要先经过酸、碱浸泡清洗，用水洗至中性，然后再转型，以备再次上柱进行交换。如此循环往复，离子交换剂可反复使用一段较长的时间。如离子交换柱要较长时间停用，可在再生后，加入适当的防腐剂以防止微生物生长。阳离子交换树脂常用0.02%的叠氮钠作为防腐剂。而阴离子交换树脂常用的防腐剂是10ppm的苯乙酸汞等。,11December2019,18,（三）凝胶过滤层析,1、原理：依据分子筛效应，按分子的大小和形状来分离样品。当样品经过分子筛介质时，由于分子筛有一定大小和孔径，小分子样品进入颗粒内部，大分子由于进不了颗粒内部而直接流出来，它与进入颗粒的小分子相比，流过柱的路程相对较短。2、分配系数（Kd）：反映凝胶对溶质排阻程度的量。Kd值的意义Kd值的计算3、凝胶种类：葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶常用凝胶过滤层析介质4、影响凝胶过滤的因素：5、凝胶过滤层析的应用：,Ve-VoVi,Kd=,11December2019,19,1、凝胶过滤层析的原理,11December2019,20,2、分配系数,为了定量地衡量各组分的流出顺序，常常采用分配系数Kd来量度。Kd值是反映凝胶对溶质排阻程度的量。Ve：某组分的洗脱体积，该组分从加进层析柱到流出液中该组分出现高峰时所用洗脱液体积（mL）Vo：外（水）体积，层析柱内凝胶之间空隙的体积（mL）Vi：内（水）体积，层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积(mL),11December2019,21,（1）Kd值的意义,Kd=0时即Ve=Vo，该组分足够大，不能进入微孔，最先流出。Kd=1时即Ve=Vo+Vi，该组分可进入全部的微孔，最后流出。0Kd1Kd小的先流出，Kd大的后流出。,Kd可定量地衡量各组分的流出顺序，也是判断分离效果的参数。当Kd差异大时，分离效果好，差异小时，分离效果差。,Ve-VoVi,Kd=,11December2019,22,（2）Kd值的计算,Ve、Vo和Vi与凝胶种类、凝胶型号、凝胶处理方法、装柱量的多少以及装柱质量等因素都有密切关系。对于不同的凝胶柱，其数值都往往不同。所以，需要在装好凝胶柱后，在使用于酶液分离之前，通过试验，测定该层析柱的Vo和Vi（图例），并对某些已知组分的Ve进行测定，从而计算出其Kd值。在凝胶柱装好后，要尽量维持相同的使用条件，使各组分的Kd值保持一定，即保持各组分的流出顺序，从而达到良好的分离效果。,11December2019,23,Vo和Vi的测定,当把分子量不同的混合溶液铺在凝胶床上时，其在内水体积和外水体积中的分布是不一样的。Vo：溶液中的分子大于凝胶孔径上限者不能进入凝胶网孔内，如蓝色葡聚糖（bluedextran，分子量约2000000），而被排阻在外水体积的溶液中。凝胶床的洗脱体积Ve刚好等于外水体积。即Ve=Vo(Kd=0)。Vi：溶液中的分子小于凝胶孔径下限者,（如T2O，tritiumoxide，氧化氚，氚水）能自由进入凝胶网孔内，凝胶床的洗脱体积Ve应等于凝胶床总体积，即Ve=Vt=Vo+Vi(Kd=1)。也可从凝胶干、湿重差求得。而溶液中的分子大小介于凝胶孔径上限和下限之间者，则能进入部分凝胶网孔中，故其洗脱体积Ve是在Vo和Vt之间（Kd在01之间）。,11December2019,24,（1）葡聚糖凝胶,构成：以葡聚糖（葡萄糖通过1，6糖苷键结合而成的线性高分子）为单体，以1，2-环氧氯丙烷为交联剂聚合而成。Sephadex：G值后的数值为该类型凝胶膨润时吸水量的10倍。如：G-25表示1g凝胶可吸收2.5ml水。G值小，吸水量少，凝胶孔径小，适合于较小分子的分离；G值大，吸水量多，凝胶孔径大，适合于较大分子的分离。特点：有良好的化学稳定性（耐酸碱）和热稳定性，室温保存要防腐。葡聚糖凝胶系酸性物质，能与碱性蛋白发生吸附作用。当离子强度大于0.05时吸附作用可丧失。葡聚糖凝胶的操作流程,11December2019,25,葡聚糖凝胶的操作流程,选择凝胶和溶胀：可根据分子量大小范围选择凝胶，还有粗中细之分，粗分用中粗的凝胶，分析工作用细的凝胶。水浸过夜或沸水煮2hr（速度快且可以杀菌）。装柱：均匀、无纹路、无气泡（兰色葡聚糖2000检验），用缓冲液平衡。上样和洗脱：体积不超过柱床体积的1/40。然后用缓冲液洗脱，注意流速和操作压。再生：稀盐和缓冲液洗涤，保存在液体中，为防止微生物生长，加0.02%NaN3（使用时可能会抑制所要分离的酶）。,11December2019,26,（2）琼脂糖凝胶,构成：由D-半乳糖和3,6-脱水半乳糖连接构成的糖链。本身不包含另外的交联物质，依靠糖基之间的氢键作用形成稳定的网状结构。Sepharose：数字表示琼脂糖含量（2B表示含量为2%），数字越大含量越高，但筛孔越小。特点：孔径较大，非特异吸附作用小，但稳定性差。Sepharose-CL型：是琼脂糖在强碱性条件下与1,3-二溴异丙醇生成的交联型琼脂糖。孔径与同浓度未交联琼脂糖相同，但热稳定性和化学稳定性都有提高，可在0-40、pH3-14间使用。,11December2019,27,（3）聚丙烯酰胺凝胶,构成：人工合成凝胶。是以丙烯酰胺为单体，以甲叉双丙烯酰胺为交联剂聚合成的高分子聚合物，通过改变单体和交联剂浓度可改变凝胶孔径。Bio-gelP系列：P值越大孔径也越大，数值*1000表示排阻限度，可根据欲分离的分子量选择适宜的凝胶。特点：属于惰性凝胶，但遇强酸时，可能使其中的酰胺键水解而遭到破坏。,11December2019,28,常用凝胶过滤层析介质,11December2019,29,4、影响凝胶过滤层析的因素,选择合适的凝胶粒度：细颗粒凝胶分辨率高，但洗脱慢；柱长：L/D高的柱子分辨率高，但影响流速；层析柱的装柱质量：减少气泡和裂纹；样品体积：量少，分辨率清晰，用于分析目的时不超过柱床体积的5%，脱盐时10%左右。制备层析可25%-30%；洗脱液的流速：流速快分辨率低。,11December2019,30,5、凝胶过滤层析的应用,生物大分子的脱盐和浓缩；分离生命物质（对某些理化性质相似如溶解度、带电性质等，但分子量不同的混合液）；去除热源物质；分子量检测；其它：DEAE-Sephadex可作为离子交换层析介质。,11December2019,31,（四）亲和层析,1、原理：利用生物大分子与配基之间所具有的专一又可逆的结合，将配基共价连接在固相载体（基质）上，通过层析柱的生物大分子就能以其高亲和力与配基特异结合，与其它杂质分离而达到纯化目的。亲和层析是从复杂混合物中纯化蛋白质的最好的方法。2、亲和层析基质和配体：3、基质与配体偶联：4、亲和层析操作步骤：5、亲和层析的应用：,（,11December2019,32,1、亲和层析的原理,11December2019,33,2、亲和层析基质和配体,理想的基质应满足的条件：（1）能构成松散的多孔网络；（2）极低的非特异性吸附；（3）高度的亲水性；（4）较好的理化稳定性；（5）具有大量能活化并与配基结合的基团。可供选择的亲和层析基质：琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺、纤维素等。以4%的交联琼脂糖（Sepharose4B）最为常见。亲和层析配体的条件：（1）与纯化的物质有较强的亲和力；（2）具有与基质共价结合的基团。如：底物、底物类似物、别构酶的效应因子、辅因子、抑制剂、抗体、染料等。,11December2019,34,亲和层析的几个名词,在成对互配的生物分子中，可把任何一方作为固定相，而对样品溶液（流动相）中的另一方分子进行亲和层析。例如，酶与其辅酶是分子对，既可把辅酶作为固定相，对样品液中的酶进行亲和层析分离；也可把酶作为固定相，使样品液中的辅酶分离纯化。在亲和层析中，作为固定相的一方称为配体（配基）。配基必须偶联于不溶性母体上。母体又称载体或担体或基质，一般采用琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和纤维素等作为母体。活化后的不溶性母体已有商品出售，商品名为偶联凝胶。,11December2019,35,3、基质和配体的偶联,基质的活化：CNBr法：作用于葡聚糖或琼脂糖的羟基上，形成活泼的亚氨基碳酸盐衍生物。引入连接（手）臂：通过直接偶联的方式得到的亲和吸附剂，基质和配基间距离较近，形成空间位阻，难于进行亲和作用。通常在基质与配体间引入适当长度的连接臂。使配基能自由伸入溶液而增进对酶分子的吸附效率。常用的连接臂为二胺化合物。图例偶联：一般在活化后快速进行。,OH,OH,CNBr,O,O,C=NH,pH11,11December2019,36,亲和层析连接臂的作用,11December2019,37,4、亲和层析操作步骤,（1）制备亲和层析剂选配基选偶联凝胶偶联例（2）装柱层析亲和层析剂制备好后，装进层析柱。当酶液流经亲和层析柱时，酶与其配基结合，留在柱内，而其他杂质不与配基结合，可洗涤流出。（3）洗脱用洗脱液将酶洗脱出来，达到分离纯化。洗脱时要选择好洗脱剂及洗脱条件，使原已亲和吸附在配基上的酶不受损害地洗脱下来。洗脱过程中酶与配基的亲和力降低而解吸。例注意事项：在酶的亲和层析过程中，为了防止酶变性失活，并使亲和层析剂免受损害，一般应在低温（010）的条件下进行操作。,11December2019,38,制备亲和层析剂实例,在酶的亲和层析分离纯化中，大多数采用琼脂糖凝胶为母体，选用适宜的配基制成亲和层析剂。例如，以细菌细胞壁的水解产物为配基，偶联于琼脂糖凝胶上，用于溶菌酶的分离纯化；用环状糊精作为配基，以环氧化物活化的琼脂糖凝胶为母体制成亲和层析剂，用于分离纯化-淀粉酶；以辅酶为配基，制成亲和层析剂，可用于以辅酶为辅酶的酶的纯化，如乳酸脱氢酶。,11December2019,39,亲和层析洗脱举例,以卵类粘蛋白为配基，在pH78的条件下，胰蛋白酶与配基亲和吸附，而以pH23的缓冲液可将胰蛋白酶洗脱出来。,11December2019,40,5、亲和层析的应用,纯化大分子物质：酶的纯化、糖蛋白的纯化（以凝集素做配体）、抗体纯化（以抗原做配体）研究酶的结构与功能。将有生物活性的蛋白和失去活性的蛋白分开，也可进行活力检测。,
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