【基金标书】2010CB945400-干细胞向生殖细胞诱导分化的调控机理及应用性研究

项目名称： 干细胞向生殖细胞诱导分化的调控机理及应用性研究首席科学家： 松阳洲 中山大学起止年限： 2010年 1月-2014 年 8月依托部门： 教育部一、研究内容本项目将以胚胎干细胞及诱导多能干细胞（iPS）为技术平台，研究哺乳动物干细胞向生殖细胞分化以及生殖细胞减数分裂的调控网络和机理，并建立研究生殖细胞分化所需的生物技术平台及多种细胞及小鼠模型，从而提高干细胞向生殖细胞诱导分化的效率，为大型 经济动物优质培育奠定基础。（1）利用蛋白质组学，BiFC 组学, 信息学研究平台，建立以 PGC 关键调控元为中心的信号调控网络，筛选控制 PGC 基因表达的关键因子，并 阐述端粒蛋白以及端粒酶在干细胞向 PGC 诱导分化过程中的作用机理。同时利用表观遗传学研究技术，分析 PGC 诱导过程中组蛋白修饰的动态过程和不同修饰与 PGC 发育之间的相互关系。探讨以上关键信号调控网络、关 键因子在诱导牛干细胞向生殖细胞分化过程中的调控机理。 (2) 利用基因组学、蛋白质组学研究技术，系 统地分析精原干细胞和胚胎干细胞的特异性差异。阐明雄性生殖细胞中诱导减数分裂的分子机制，建立干细胞体外诱导分化雄性生殖细胞的理论体系，并分析体外生成生殖细胞的生物学功能。(3)以人及小鼠胚胎干细胞体外分化系统为模型，优化 PGC 特化的条件，并通过转基因及基因敲除的方法，探索关键转录因子及信号网络在 PGC 形成过程中的功能及调控机理。(4)建立较为完善的牛 ES 细胞体外培养体系，探讨牛干细胞自我更新和分化途径。通过转基因技术、选择合适的生长因子、 转录因子和培养体系诱导牛 ES 细胞分化为雄性生殖细胞，并建立相应的技术平台。二、预期目标总体目标本项目以研究诱导分化技术、蛋白调控网络、减数分裂机理及农业经济动物培育为主线，紧密围绕以上 3 个拟解决的关键科学问题。在建立的多种技术平台的基础上， 确立以 PGC 关键调控元为中心的信号调 控网络， 筛选控制 PGC 基因表达的关键因子。系统地分析精原干细胞与胚胎干细胞之间特异性差异，阐明雄性生殖细胞中诱导减数分裂的分子机制。同时，建立体外诱导培养功能性生殖细胞的技术体系，以小鼠为主要研究对象， 尝试应用干 细胞诱导产生的生殖细胞来培育优化动物，最终确立我国在这一极富竞争性的前沿探索领域的领先地位。五年预期目标1，发展基于干细胞学和生殖细胞学研究的一整套方法和综合技术平台。2，建立以 PGC 关键调控元为中心的较为完整的信号调控网络， 筛选出控制 PGC基因表达的几个关键因子。3，明确端粒蛋白以及端粒酶在干细胞向 PGC 诱导过程中的作用机理，并揭示 组蛋白修饰的动态过程和不同修饰与 PGC 发育之间的相互关系。4，明确精原干细胞和胚胎干细胞之间的基因表达差异，确定 3-6 个差异表达基因。5，阐明雄性生殖细胞中诱导减数分裂的分子机制。6，建立一整套诱导 PGC 生成的培养体系。7，建立 1-3 个体外培养生长状况良好、表达干 细胞 标记的牛 ES 细胞系，初步 阐明牛干细胞自我更新和分化的可能途径。8，力争建立牛 ES 细胞体外 诱导分化形成功能性配子（精子、卵子）的技 术体系。9，在国际重要学术刊物上发表高水平论文 40 篇以上。其中影响因子大于 10 的论文 8 篇以上。10，培养一批从事干细胞研究的交叉学科人才。11，主办一次生殖细胞学研究的国际性学术研讨会。12，申请发明专利 10 项以上。三、研究方案1，总体思路干细胞具有自我更新、高度增殖和多向分化的潜能。 干细胞的功能则是通过细胞内外因子对蛋白质组和基因组的动态调控来实现的。 因此探讨干细胞生长微环境、蛋白质间 相互作用、 组蛋白修饰与基因表达之间的相互关系，并依此建立干细胞向生殖 细胞分化的调控蛋白质网络和定向诱导技术体系将是本项目的重要研究方向。2，技术途径根据以上的学术思路，本项目的总体研究技术途径如图2所示。具体地，本项目将首先建立能够系统挖掘生殖细胞靶蛋白及其体外诱导分化的技术手段与平台，包括：蛋白质组 学平台、蛋白 质BiFC 表达 库和RNAi 库、生物信息学技术平台和动物模型技术平台。通过这些平台，系 统 地发现与生殖细胞分化相关的调控网络，并进一步利用现代分子生物学、 细 胞培养等技术确定一些蛋白质的靶蛋白网络和功能以及调控机理。在这些基础研究的基础上，进一步以小鼠和农业经济动物为研究对象，应用干细胞诱导产生的生殖细胞来培育优化动物。 3，可行性分析本项目的总体方案是切实可行的。首先，本 项目提出的主要科学问题和研究目标不仅具有理论和实际依据，而且都是该领域前沿性和关键性的问题。我们在干细胞学、胚胎发育学、生殖学等领域进行了多年的研究，取得了一些重要的成果，具备 完成本项目的坚实 基础。研究方案建立在申请者以及项目组成员大量的相关研究工作的基础上，实验设计合理周密。研究 课题 所用的方法和材料都是本项目组成员多年应用、被证 明是行之有效的方法；而且，我们的课题组成员积累了大量的关键性研究材料，如各种ES 细胞系，iPS细胞，转基因鼠，牛等，可为本项目的实施提供强有力的保证。其次， 项目承担单位具有良好的研究条件和基础，并且已经具备了相当的规模、取得了很好的科研成果。我们拥有完善的蛋白质组学，BiFC，基因组学，信息学，干细胞学等研究平台，可以完成本项目所涉及的研究工作。中山大学及其他参与的单位拥有大型及关键性仪器设备，采用公共平台建设方式，已拥有的条件（ 动物房和仪器设备等）、各重点学科实验室等设备均可公用，这将为本项目提供较全面的技术条件。本 项目注重各研究课题之间的配合、确保信息共享，发挥专业交叉、知识互补、团结协作的精神，确保本项目圆满、顺利完成。其三，承担本项目研究工作的中坚力量和学术骨干多数是新近从海外留学工作归国的成绩卓著的中青年科学家，拥有丰富的研究成果和研究经验，多次在国际著名专业杂志上发表论文。这些都是确保研究项目顺利实施和取得重大成果的最基本、最关键的因素。本项目课题组成员熟悉当前的研究状况和方法，对本项目的研究具有较强的掌控能力和应变能力，能够保证项目的顺利完成。4，创新点本项目探讨影响国计民生的的重大科学问题。项目中的四个子课题既相互独立，又交叉互补。这些课题既是有关研究人员各自多年工作的合理延伸和拓展，又集中了优势力量，对诱导 干细胞向生殖细胞分化中的核心问题进行多侧面的合作研究。本题目的创新性主要体现在：(1)本项目探讨 的问题是国际前沿的科学问题，因此保证了项目的创新性。本项目的选题涉及干细胞向生殖细胞分化过程中重要蛋白调控网络；雄性生殖细胞体外诱导分化的基因表达及调控机理；胚胎干细胞向原始生殖细胞分化的体系及机理；干细胞向生殖细胞诱导分化技术在农业经济动物培育上的应用等科学问题。将基础科学与实际应用相结合，力争在解答基础科学问题的同时，发展新的动物繁殖技能。(2)本项目在充分利用 课题组已建立的蛋白质组学研究平台，BiFC研究平台（松阳洲教授研究团队独创），信息学研究平台和基因组学研究平台的基础上，发展和创建综合技术平台及多种细胞和动物模型，分析从干细胞诱导生成生殖细胞过程中的蛋白调控网络和基因调控机理，填补生殖细胞发育机理和干细胞分化机制研究领域的空白，为干细胞的再生医学及畜牧产业的应用提供新的途径。(3)本项目着眼于 技术创新, 通过建立诱导干细胞生成生殖细胞的技术体系，获得功能性生殖细胞，为大型经济动物优良种群的培育提供技术支持。同时，通 过建立大型经济动物胚胎干细胞，研究在体外特定条件下的分化潜能，尝试培育生长性能好、环境友好型、品质优良的新品种。 这些可为 人类提供高品质食源，具有非常明显的创新性。通过这些尝试，可能开辟家畜育种和保种的新途径、新方法，也可以促进干细胞在人类医疗事业上的早日应用。5，组织方式(1)在组织方面，以总体研究方案为中心，强调团队化、体系化。瞄准 战略目标，统一思路，力求持续发展。项目规划管理和运作体制包括总项目和子课题两个层次。项目设负责人 1 名（首席科学家），负责整个项目的 贯通实施。首席科学家聘任若干学术专家组成项目顾问专家组，参与项目的领导、组织、运行和管理， 协助项目负责人，调整和确定项目的方向及技术路线，制定有效可行的研究计划，指 导协调各课题的工作，督促各课题间的交流，并 审核各子课题的进展情况。 顾问专家由相关学科领域成就卓著的专家组成，承担单位之外的专家占绝大多数。(2) 在研究方面，不只停留在单项技术或研究手段上，而是发展综合技术平台及多种细胞和动物模型。为此，本项目将以系统性运作方式为主。不但充分 发挥子课题各承担单位的技术和学科优势，而且加强优势力量的整合和协同攻关，发扬团队精神，形成科研功能配套、统筹合理、机 动灵活且充 满活力的科研体系。6，课题间的相互关系本项目以中山大学为主体，联合中国科学学院， 华东师范大学及中国农业大学等单位， 围绕总体研究目 标，本 项目设立4个课题组 ，研究 过程中相互配合、优势互补，提倡资源共享。本项目的执行采用首席科学家 负责制。首席科学家将充分发挥课题负责人和学术带头人的作用，采用学科交叉、分工合作的方式来实施研究计划。同时，首席科学家将在相关部门的领导下，根据国家规定，通过项目专家委员会，采用激励和滚动机制对项目进行管理。本课题设置上紧密围绕干细胞诱导生成生殖细胞这一重大科学问题，以研究诱导分化技术、蛋白调控网络、减数分裂机理以及农业经济动物培育为主线，将各个课题有机地结合起来，使各方面的研究工作既具有明确的研究目标，同时又相互紧密联系，形成我国在这一前沿领域的研究特色。本项目期望在诱导干细胞生成生殖细胞关键科学问题上取得重大突破性成果，保证按期完成项目的总体目标和五年目标。课题 2. 雄性生殖细胞体外诱导分化的基因表达及调控机理研究课题 1. 干细胞向生殖细胞分化过程中重要蛋白调控网络的解析干细胞向生殖细胞诱导分化的调控机理及应用性研究阐明干细胞向生殖细胞分化机理产生功能性配子与克隆动物建立以PGC 关键调控元为中心的信号调控网络全面了解转录因子和组蛋白修饰在PGC 形成中的功能与调控机制阐述端粒蛋白以及端粒酶在干细胞向 PGC诱导过程中的作用与机 理探索诱导分化的生殖细胞的生物学功能及其对小鼠胚胎发育的影响比较ESC和 SSC DNA甲基化模式、基因表达和细胞表面蛋白成分的差 异检索RA 信号调控的靶基因,分析减数分裂的机 理探讨在诱导牛干细胞向生殖细胞分化过程中信号调控网络课题 3. 诱导胚胎干细胞向原始生殖细胞分化的体系及机理研究优化促进 PGC形成的最佳体外培养条 件探讨关键基因在小鼠PGC 特化过程中的功能及体内转录调控模式创建表达标志PGC 特化的报告基因体 系，探讨关键信号网络的调控机 理课题 4. 干 细 胞向生殖 细 胞 诱导 分化技术 在 农业经济动 物培育上的 应 用建立合适的牛ESC 体外培养体系利用创建的牛ESC 体系，探讨牛干细胞自我更新和分化的途径诱导牛ESC 分化为雄性生殖细胞建立以ESC 体外诱导分化为功能性生殖细胞的技术平台课题1，干细胞向生殖细胞分化过程中重要蛋白调控网络的解析研究目标：建立和完善高通量研究蛋白互动网络以及干细胞向生殖细胞分化的技术平台，包括蛋白质组学平台，BiFC 组学平台, 基因组学平台，生物信息学平台。在此基础上，发现若干新的调控干细胞向生殖细胞分化的关键转录因子和染色质修饰因子，在整体细胞水平上初步确立干细胞向生殖细胞分化的网络系统。研究内容：1, 以一些 PGC 表达的关键调控元，如 Nanog, Oct4，RAR/RXR, Smad 为研究对象, 运用蛋白质组学及 BiFC 组学平台, 系统地发现直接与关键调控元相互作用的蛋白, 并依此建立以 PGC 关键调控元为中心的信号调控网络。2, 以 Blimp1 、Stella, PITX2, c-kit、Stra-8, vasa 和 DAZL 等重要的 PGC 表达基因为模式， 从 PGC 或生殖母细胞调控元及与其相互作用的蛋白质组中筛选出控制这些基因表达的关键因子。从表观遗传学着手，研究 PGC 诱导过程中组蛋白修饰的动态过程和不同修饰与 PGC 或精子发育之间的相互关系，以全面了解转录因子和组蛋白修饰（着重于组蛋白酰基化、甲基化的研究）在 PGC 形成中的功能与调控机制。3, 利用四环素调节表达系统, RNAi, ChIP 等技术阐述端粒蛋白以及端粒酶在干细胞向 PGC 诱导过程中的作用与机理。4, 探讨在诱导牛干细胞向生殖细胞分化过程中，以上信号调控网络的适用性。课题承担单位： 中山大学 课题负责人： 松阳洲 教授 （中山大学）主要学术骨干： 张 雁 教授 （中山大学）项 鹏 教授 （中山大学）周天寿 教授 （中山大学）张勤奋 副教授 （中山大学）王继刚 讲师 （华东师范大学）李鲲鹏 讲师 （中山大学）课题经费比例： 占申请经费的31%课题 2，雄性生殖细胞体外诱导分化的基因表达及调控机理研究研究目标：通过对精原干细胞和胚胎干细胞的表观遗传，基因表达和表面蛋白差异的系统分析，对视黄素(RA)信号通路及其在精子生成 细胞中诱导减数分裂功能的特异性分析，阐述精原干细胞分化的调控机制，为干细胞体外诱导分化雄性生殖细胞提供依据。研究内容：1，利用测序的方法（如 CpG 二核苷酸位点上的甲基化）， cDNA 基因芯片的筛选，蛋白质组学和质谱分析技术，系统地比较胚胎干细胞和精原干细胞 DNA 甲基化模式、基因表达和细胞表面蛋白成分的差异。2，通过生物信息学技术，利用 RAR/RXR 在 DNA 结合区域的序列保守性，检索精子前体细胞中 RA 信号调控的靶基因。分析核受体 RAR/RXR 复合体在精原细胞中的特异性及其调节减数分裂的机理。3利用全细胞成像及分子生物学技术分析诱导分化的雄性生殖细胞，通过小鼠曲细精管内细胞注射和卵细胞胞浆内精子注射，探索体外诱导分化的生殖细胞的生物学功能及其对小鼠胚胎发育的影响。课题承担单位：中国科学院广州生物医药与健康研究院课题负责人： 杨东山 副研究员（中国科学院广州生物医药与健康研究院）主要学术骨干：戚华宇 研究员 （中国科学院广州生物医药与健康研究院）谢 亭 教授 （中国科学院广州生物医药与健康研究院）徐仁和 教授 （中国科学院广州生物医药与健康研究院）课题经费比例：占申请经费的23%。课题3， 诱导胚胎干细胞向原始生殖细胞分化的体系及机理研究研究目标：本课题将完善胚胎干细胞分化为 PGC 的技术体系，建立 PGC 特化过程中关键因子的转基因及基因敲除的胚胎干细胞株及小鼠模型，揭示关键转录因子及信号网络在 PGC 形成过程中的功能及调控机理。研究内容1， 使用我们现有的 Oct4-GFP 及 Stella-GFP 胚胎干细胞株, 结合其它 PGC 特异性分子标记，利用无血清培养方式, 优化促进 PGC 形成的最佳体外条件；并以gonadal 细胞共培养的方式建立适合 PGC 生长的微 环境。2， 利用转基因及基因敲除技术，建立特定基因过量表达或缺失的胚胎干细胞株及小鼠模型，探讨关键基因（如激素受体及 BMP 家族）在小鼠 PGC 特化过程中的功能及体内转录调控模式。 3，在人胚胎干细胞中创建稳定表达标志 PGC 特化的报告基因体系 (Blimp1-GFP 和 Stella-GFP 等)，以有效地 监测 PGC 的形成，并利用此体系，优化从人胚胎干细胞诱导分化 PGC 的条件，探 讨关键转录因子及信号网络的调控机理。课题承担单位： 华东师范大学课题负责人： 王 媛 特聘教授 （华东师范大学）主要学术骨干： 李大力 副研究员 （华东师范大学）周文良 教授 （中山大学）叶希韵 副教授 （华东师范大学）课题经费比例： 占申请经费的23%。课题 4，干 细 胞向生殖 细 胞 诱导 分化技 术 在 农业经济动 物培育上的 应 用研究目 标 ：建立牛 ES 细胞的体外培养体系和体外定向 诱导分化技术平台，从而揭示牛多能干细胞体外分化与发育的潜能,获得具有生物活性的配子（精子、卵子），利用这些技术加速优良经济动物种群的培育。研究内容：1，参照人和动物 ES 细胞建系的技 术，选用不同胚 龄及各种附植前牛胚胎的内细胞团，建立合适的牛 ES 细 胞体外培养体系。4，以其它子课题的蛋白网络调控等相关研究为基础，利用创建的牛 ES 细胞体系，探讨牛干细胞自我更新和分化的途径。5，通过转基因技术、选择合适的生长因子、 转录因子和培养体系诱导牛 ES 细胞分化为雄性生殖细胞，为经济动物的改良服务。6，以牛 ES 细胞诱导分化而来的精子为核供体，分析胞质内注射后胚胎的发育能力，建立以 ES 细胞体外 诱导分化为功能性生殖细 胞的技术平台。课题承担单位： 中国农业大学课题负责人： 朱 捷 教授 （中国农业大学）主要学术骨干： 陈瑶生 教授 （中山大学）周光斌 副教授 （中国农业大学）于政权 副教授 （中国农业大学）课题经费比例 占申请经费的23%四、年度计划第一年：1, 建立较为理想的从小鼠胚胎干细胞诱导 PGC 形成的培养体系。2，检测不同生长因子的诱导作用,并尝试体外诱导 PGC 减数分裂形成功能性配子。3，利用蛋白质组学及 BiFC 组学研究技术, 系统地从 human ORFeome (12000 个基因) 或其他逆 转录病毒表达 库中筛选直接与 Nanog, Oct4，RAR/RXR, Smad 相互作用的蛋白。4，分离、纯化精原干细胞，利用 RAR/RXR 在 DNA 上结合区域的序列保守性，通过生物信息学，分析、检索含有与 stra8 等同源的调控区的新基因，寻找已知减数分裂基因组中在精子前体细胞中表达，受视黄酸诱导调控的基因，为研究减数分裂调控机制检索目标基因。5，开展小鼠曲细精管注射及卵母细胞胞浆注射实验，建立精原干细胞和精子细胞的功能检测体系，以便于对体外诱导分化所得精原（精子）细胞的生物学功能加以验证。6，建立特定基因过量表达或缺失的转基因及基因敲除载体。7，在人胚胎干细胞中创建稳定表达标志 PGC 特化的报告基因体系。8，优化牛 ICM 细胞体外维持多能性的细胞因子组合，尝试获取牛类胚胎干细胞系和体外培养的技术平台。预期目标：1，建立和完善高通量研究蛋白互动网络的技术平台，包括蛋白质组学平台，BiFC 组学平台, 基因组学平台，生物信息学平台。2，分离获得小鼠精原干细胞；初步完成精子前体细胞中生物信息学分析，确定2-3 个受 视黄酸诱导调控并参与减数分裂调控的目标基因。3，初步建立胚胎干细胞（或诱导多能干细胞）体外培养和诱导分化的培养体系。4，建立小鼠曲细精管注射及卵母细胞胞浆注射技术体系。5，成功诱导小鼠胚胎干细胞分化成为 PGC，检测 RA、BMP 等 5 种以上信号分子对 PGC 分化的影响。6，构建小鼠配子中特异表达的 Gpr126 等 3-5 个重要基因的条件敲除 载体或转基因载体。7，构建 Blimp1-GFP 和 Stella-GFP 等 PGC 特化报告基因稳定表达的人胚胎干细胞。8，获得促使牛 ICM 细胞体外维持多能性的最佳细 胞因子组合，建立 8 个体外培养生长状况良好、表达干细胞标记的牛类胚胎干细胞系。9，建立牛胚胎干细胞体外培养体系。10， 撰写论文 1-2 篇。第二年：1，在前年度研究结果的基础上，继续完善体外胚胎干细胞（诱导多能干细胞）诱导分化精子细胞的有效途径，利用已知精原干细胞的标志基因以及带有精子前体细胞荧光标记蛋白的小鼠对体外诱导产生的细胞加以检验。2，通过过量表达或 RNAi 的研究手法，从 PGC 或生殖母细胞调控元及与其相互作用的蛋白质组中筛选出控制 Blimp1, Stella, PITX2, c-kit、Stra-8, vasa 和DAZL 基因表达的关 键因子。3，利用生物信息学研究手法，建立以 PGC 关键调控元为中心的信号调控网络。4，利用测序的方法（如 CpG 二核苷酸位点上的甲基化）分析精原干 细胞和胚胎干细胞的基因组 DNA，印迹基因和一些关 键的多能性基因的 DNA 甲基化模式。5，对经过视黄酸刺激的精原干细胞进行基因芯片分析来研究其表达谱。利用特定的抗体进行免疫沉淀或染色质免疫沉淀对视黄酸在生殖细胞中的受体、辅助受体复合物进行生化分析。设计、构建相关 载体、 DNA 文库，用以筛选与视黄素受体相互作用的蛋白。6，建立清除内源精原干细胞的野生型小鼠或缺失精原干细胞的突变型小鼠，用于曲细精管注射检测体外培养的精原干细胞的生物学功能。建立稳定的胞浆内精子注射技术平台。7，通过报告基因和表面抗原标记，筛选在体外培养体系中参与 PGC 特化的生长因子和激素等细胞外因子或小分子化合物。8，以 gonadal 细胞共培养的方式建立适合 PGC 生 长及减数分裂形成功能性配子的微环境。9，在优化的体外培养条件下诱导 ESC 向 PGC 分化，运用基因芯片和定量 PCR等技术筛选 PGC 特异的基因（主要是 GPCR 和其他受体介 导的信号传导分子）并研究其表达模式。10， 利用转基因及基因敲除技术，建立特定基因过量表达或缺失的胚胎干细胞株或小鼠杂合体模型。11， 利用上述人胚胎干细胞中创建 PGC 特化的报告基因体系, 建立完善从人胚胎干细胞诱导 PGC 生成的培养体系。12， 进一步探索已建立的牛类胚干细胞系体外分化为三个胚层的能力及种系嵌合的研究。13， 探索已建立的牛胚胎干细胞体外培养条件可否适合体外来源的牛胚胎（体外受精胚胎和体外克隆胚胎）的可行性。14， 利用创建的牛 ES 细胞体系，初步探 讨牛 ES 细胞自我更新和分化途径。预期目标：1，筛选出控制 PGC 基因表达的 6-8 个关键因子。2，建立以 PGC 关键调控元为中心的较为完整的信号调控网络。3，完成精原干细胞和胚胎干细胞、诱导多能干细胞的 DNA 甲基化测序。4，完成对精原干细胞的基因芯片分析，确定 2-3 个受视黄酸刺激表达明显上调的基因。5，对视黄酸受体、辅助受体复合物进行生化分析，确定其基本成分；设计、构建用于筛选相关蛋白相互作用的载体、DNA 文库。6，获得清除内源精原干细胞的野生型小鼠或缺失精原干细胞的突变型小鼠，获得精子注射小鼠后代。7，在无血清培养条件下，建立 ESC 向 PGC 分化的最佳体外培养体系。8，鉴定 PGC 参与调节 ESC 特化为 PGC 过程中的生 长因子、激素或小分子化合物。9，建立适合 PGC 生长及减数分裂的 gonadal 细胞共培养体系。10， 鉴定 ESC 分化为 PGC 个阶段的差异表达基因，明确它 们的表达模式。11， 建立特定基因过表达和 knockdown 的 ES 细胞株，得到嵌合体小鼠（第一批）。12， 获得 3 个以上特定基因敲除的小鼠干细胞品系。13， 完善从人胚胎干细胞诱导 PGC 生成的培养体系。14， 建立 1-3 个具备生殖嵌合能力的牛胚胎干细胞系。15， 与其他子课题的蛋白网络调控等相关研究为基础，初步阐明 LIF-STAT3等信号通路在维持 ES 细胞自我更新中的作用。16， 撰写论文 6-8 篇，申请专利 1 项。第三年：1， 利用高通量的染色体免疫沉淀结合全基因组 DNA 芯片或短序列测序技术（“ChIP-chip”和“ChIP-seq”），研究 PGC 诱导过程中组蛋白修饰的动态过程。2， 利用贝叶斯网络推测组蛋白各种不同修饰和基因表达之间的因果关系及组合关系，并推测组蛋白修饰相互之间形成的逻辑关系。3， 全面筛选与组蛋白修饰相关的基因，通过基因敲除或过量表达，验证不同修饰与 PGC 或精子发育之间的相互关系，以全面了解转录因子和组蛋白修饰（着重于组蛋白酰基化、甲基化的研究）在 PGC 形成中的功能与调控机制。4， 用特定的抗体通过 Western 杂交和免疫细胞化学的方法比较精原干细胞和胚胎干细胞中与控制基因表达相关的组蛋白修饰模式的差异，如H3K4me，H3K9me 等。5， 根据生物信息学分析结果，挑选几个相关基因开展分子、细胞等方面的生物学实验详细检测它们对精原细胞减数分裂的影响。利用所构建的相关载体、DNA 文库筛选与视黄素受体相互作用的蛋白。6， 根据精原干细胞与胚胎干细胞差异分析的初步结果，在已知的实验条件基础上改进，以期找出胚胎干细胞体外诱导精子细胞的更有效方法。7， 利用小鼠曲细精管注射实验，检测体外诱导分化所得精原干细胞形成克隆的能力，通过分子和细胞生物学的方法检测其衍生细胞。通过体外受精和胞浆内精子注射技术检测其衍生细胞的生物学功能。8， 在第一和第二课题筛选的在 PGC 特化和配子减数分裂过程中有重要功能的转录因子或辅因子中，选择几个代表性基因构建转基因或基因敲除载体，筛选基因打靶的 ES 细胞株；9， 对已构建的小鼠模型进行表型分析，鉴定目的基因的生理功能和下游信号传导途径；10， 研究参与 PGC 特化的生长因子和激素等细胞外因子或小分子化合物参与调控的分子机理，进一步优化培养体系。11， 已建立的不同胚胎来源（体内胚胎、体外受精胚胎和克隆胚胎）的牛 ES 细胞进行基因表达分析。12， 探索牛 ES 细胞体外定向诱导分化形成具有功能性配子（精子、卵子）的能力。预期目标：1，把握 PGC 诱导过程中组蛋白修饰的动态过程。2，发现若干个新的调控干细胞向生殖细胞分化的关键转录因子和染色质修饰因子。3，揭示组蛋白修饰的动态过程和不同修饰与 PGC 发育之间的相互关系。4，完成精原干细胞和胚胎干细胞（诱导多能干细胞）组蛋白修饰模式的检测和比较；5，完成生物信息学分析结果确定的相关基因对精原细胞减数分裂的影响研究，初步完成相关载体、DNA 文 库的构建，筛选与视黄素受体相互作用的蛋白，确定 1-2 个参与减数分裂调节的新基因；6，体外诱导胚胎干细胞（诱导多能干细胞）产生具有精子分化表型的精原细胞，并通过小鼠曲细精管注射实验，检测体外诱导分化所得精原细胞形成克隆的能力，通过体外受精和胞浆内精子注射技术检测其衍生细胞的受精和支持胚胎发育的能力。7，构建 3-5 个第一和第二课题筛选得到的重要基因敲除载体（第二批）；8，初步完成小鼠模型的表型分析，找到这些基因可能调控的信号途径；9，阐明新发现的生长因子和激素等细胞外因子或小分子化合物参与调控 PGC分化的分子机理，进一步优化培养体系；10，探明不同来源的牛 ES 细胞分子生物学方面的差异， 为其体外诱导分化做准备。11，初步建立牛 ES 细胞体外定向 诱导分化形成具有功能性配子（精子、卵子）的技术体系。利用卵母细胞带下注射或胞质注射的方法验证诱导分化的生殖细胞的能力。12，撰写论文 8-10 篇，申请专 利 1-2 项。第四年：1，利用四环素调节表达系统, RNAi, ChIP 等技术阐述端粒蛋白以及端粒酶在干细胞向 PGC 诱导过程中的作用与机理。2，通过 cDNA 基因芯片筛选的方法系统分析胚胎干细胞（诱导多能干细胞）和精原干细胞的基因表达谱。从两种细胞中分离出的 RNA 与小鼠的表达 DNA 阵列杂交，以检测基因表达的上调或下降。3，对视黄酸在生殖细胞中的受体及辅助受体复合物的形成及其中各成分的生物学功能的分子调节机制加以研究。4，通过卵母细胞胞浆内精子注射技术检测体外诱导分化的生殖细胞是否可替代内源精子细胞支持胚胎发育，产生后代。5，建立特定基因过量表达或缺失的小鼠纯合体模型, 并研究上述特定基因过量表达或缺失的胚胎干细胞及小鼠纯合体的表型及对 PGC 及功能性配子形成的影响，探讨关键基因（如激素受体）在小鼠 PGC 特化及减数分裂形成功能性配子过程中的功能及体内转录调控模式。6，利用上述人胚胎干细胞中创建 PGC 特化的报告基因体系及 PGC 生成的培养体系，优化从人胚胎干细胞诱导分化 PGC 的条件，探讨关键转录因子及信号网络的调控机理。7，利用卵母细胞带下注射或胞质注射的方法对诱导分化的生殖细胞所形成的囊胚进行分子生物学、生理学分析及安全性检测。并为其体内发育做准备。8，召开国际生殖学研讨会。预期目标：1，明确端粒蛋白以及端粒酶在干细胞向 PGC 诱导过程中的作用机理。2，完成胚胎干细胞（诱导多能干细胞）和精原干细胞的基因表达谱的检测和比较。3，探索视黄酸在生殖细胞中的受体及辅助受体复合物的形成及其中各成分的生物学功能的分子调节机制。4，体外诱导分化获得生殖细胞，并通过卵母细胞胞浆内精子注射技术获得后代。5，完成第一批小鼠模型的表型分析和机理研究。6，初步完成重要基因在 ESC 特化为 PGC 体外功能和机理研究。7，得到优化的人 ESC 分化 PGC 的培养体系，初步阐明细胞外因子的作用机理；8，获得以牛 ES 细胞诱导而来的生殖细胞体外所形成的囊胚，利用分子生物学手段验证这些胚胎的生物活性，如甲基化、乙酰化以及端粒酶长短和活性等，并与正常体内胚胎进行比较，初步阐明这种牛 ES 细胞 诱导分化而来的生殖细胞所形成的胚胎是否具有优势、是否具备安全性。9，召开一次生殖学研讨会。10， 撰写论文 8-10 篇，申请专利 1-3 项。第五年：1，利用以上的研究手法，与课题 4 共同筛选在诱导牛干细胞分化过程中的Nanog, Oct4，RAR/RXR 的结合蛋白， 检索调控 Blimp1 、Stella, PITX2, c-kit、Stra-8, vasa 等基因表达的调控因子。明确 组蛋白修饰及端粒蛋白和端粒酶的作用。2，通过蛋白组学，分离，纯化胚胎干细胞和精原干细胞的细胞膜成分，利用蛋白双向凝胶电泳技术和质谱分析，深入研究细胞表面蛋白表达的差别，综合前四年研究结果分析胚胎干细胞和精原干细胞在 DNA 甲基化模式、基因表达和 细胞表面蛋白成分的差异，阐明造成精原干细胞和胚胎干细胞的不同发育潜力的主要原因。3，综合分析阐明通过视黄酸调控雄性生殖细胞减数分裂的机制。4，进一步研究体外诱导分化的生殖细胞通过胞浆内精子注射技术获得的后代的表型及生理功能，评估体外诱导分化获得的生殖细胞对其后代的影响。5，研究特定基因过量表达或缺失的胚胎干细胞及小鼠纯合体表型,并探讨相关的体外分子机制实验。6，结合其他课题组的研究成果,利用已完善的 PGC 及功能性配子诱导体系,检测新发现的重要基因(如 Oct4,Nanog 的相互作用分子等)的功能及分子作用机理。7，牛 ES 细胞诱导分化而来的生殖细胞所形成的胚胎体内发育能力，并与体内来源胚胎在体内正常发育进行比较研究。8，总结研究结果，汇总数据，提交研究报告，撰写论文。预期目标：1，在整体细胞水平上初步确立干细胞向生殖细胞分化的网络系统。2，完成胚胎干细胞（诱导多能干细胞）和精原干细胞表面蛋白表达的检测和比较；综合前四年研究结果，阐明造成精原干细胞和胚胎干细胞的不同发育潜力的主要原因；综合分析阐明通过视黄酸调控雄性生殖细胞减数分裂的机制；完成对卵母细胞胞浆内精子注射技术获得后代的表型分析。3，完成第二批小鼠动物模型表型分析和机理研究；4，重要基因在 ESC 特化为 PGC 体外功能和机理研究；5，将牛 ES 细胞诱导分化而来的生殖 细胞所形成的胚胎移植于同期 诱导发情的母体内，力争获得后代。6，比较分析两种胚胎生成后代牛的异同，初步阐明以牛 ES 细胞诱导分化而来的生殖细胞所形成的胚胎是否具备可行性和优越性。以期真正意义上建立牛 ES细胞体外诱导分化功能性生殖细胞的技术平台，为经济动物的改良服务。7，整理论文 8-10 篇，申 请专利 3-5 项。