2019-2020年高中生物 （人教大纲版）第二册 学生实验 1DNA粗提取与鉴定(备课资料).doc

2019-2020年高中生物 （人教大纲版）第二册 学生实验 1DNA粗提取与鉴定(备课资料)一、二苯胺试剂的配制A液：1.5 g二苯胺溶于100 mL冰醋酸中，再加1.5 mL浓硫酸，用棕色瓶保存。如冰醋酸呈结晶状态，则需加温后待其熔化，再使用。B液：乙醛的体积分数为0.2%的溶液。配制：将0.1 mL B液加入到10 mL A液中，现配现用。二、实验原理的补充介绍1.DNA的释放：DNA位于鸡血细胞的细胞核中，正常情况下不会释放出来。为了使DNA从细胞核中释放出来，实验中采用了向鸡血细胞液中加入蒸馏水并且搅拌的方法。蒸馏水对于鸡血细胞来说，是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞破裂。同时，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂（细胞膜和核膜的破裂），于是释放出DNA，当然也有RNA。但是，释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起。2.将DNA与蛋白质分离：根据二者的特性，即在浓度较高的NaCl溶液（物质的量浓度为2 mol/L）中，核蛋白容易解聚，游离出DNA。而DNA在 浓度较高的NaCl溶液中的溶解度很高，Na+与带负电的DNA结合成DNA钠盐。这时DNA在溶液中呈现溶解状态。3.DNA的析出与获取：利用DNA在浓度较低的NaCl溶液中溶解度小的原理，向含有DNA的浓度较高的NaCl溶液中加入大量（300 mL）蒸馏水，稀释NaCl溶液，使DNA的溶解度下降，而蛋白质的溶解度增高（这就是蛋白质的盐溶现象），从而使二者分离。这时，加上不停地搅拌，溶解度下降的DNA逐渐呈丝状物。再通过过滤，滤去蛋白质，就可以获取DNA的黏稠物了。如果采用离心法则更好，用4000 r/min 的旋转频率，离心15 min ，除去上清液（含有蛋白质），留下的沉淀物中含DNA。4.DNA的再溶解：再用较高浓度的NaCl溶液去溶解DNA黏稠物。5.DNA的沉淀和浓缩：除去了蛋白质的核酸溶液，必须再进一步沉淀和浓缩。最常用的方法是酒精沉淀法。就是将含有Na+的DNA溶液，加入到相当于其两倍体积的体积分数为95%冷酒精溶液中，混匀以后可以使DNA沉淀、浓缩，形成含杂质较少的DNA丝状物，悬浮于溶液中。如果出现的丝状物较少，可以将此混合液再放入冰箱中冷却几分。浓缩后的DNA丝状物，可以用缓缓旋转玻璃棒的方法卷起（因为玻璃棒有吸附DNA的作用）。6.DNA的鉴定：本实验中鉴定DNA的方法为二苯胺法。二苯胺法的原理是：DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成w羟基r酮基戊醛，它再和二苯胺作用而显现蓝色（溶液呈浅蓝色）。鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液中DNA含量的多少有关。三、鉴定DNA的其他方法用紫外灯照射法鉴定DNA效果很好。具体鉴定方法如下。1.配制染色剂。用蒸馏水配制万分之五的溴化乙锭（EB）溶液。2.将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上，再滴一滴EB溶液染色。3.将蜡纸放在紫外灯（260 nm）下照射（暗室中），可见橙红色的萤光（DNA的紫外吸收高峰在280 nm处）。四、DNA粗提取与鉴定的另一种方法1.材料用具新鲜菜花（或蒜黄、菠菜）。塑料烧杯，量筒，玻璃棒，尼龙纱布，陶瓷研钵，试管，试管架，试管夹，漏斗，酒精灯，石棉网，三角架，火柴，刀片，天平。研磨液，体积分数为95%的酒精溶液，二苯胺试剂，蒸馏水。2.方法步骤A.DNA的粗提取（1）准备材料：将新鲜菜花和体积分数为95%的酒精溶液放入冰箱冷冻室，至少24小时。（2）取材：称取30 g菜花，去梗取花，切碎。（3）研磨：将碎菜花放入研钵中，倒入10 mL研磨液，充分研磨10 min。（4）过滤：在漏斗中垫上尼龙纱布，将菜花研磨液滤入烧杯中（有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心，用1000 r/min 的旋转频率，离心25 min；取上清液放入烧杯中）。在4冰箱中放置几分钟后，再取上清液。（5）加冷酒精：将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95%的酒精溶液中，并且玻璃棒缓缓地轻轻搅拌溶液（玻璃棒不要直插烧杯底部）。沉淀35 min后，可见白色的DNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转，絮状物会缠在玻璃棒上。B.DNA的鉴定（1）配制二苯胺试剂：取0.1 mL B液；滴入到10 mL A液中，混匀。（2）鉴定：取4 mL DNA提取液放入试管中，加入4 mL二苯胺试剂，混匀后观察溶液颜色（不变蓝）。用沸水浴（100）加热10 min。在加热过程中，随时注意试管中溶液颜色的变化（逐渐出现浅蓝色）。附1：研磨液的配制方法Tris：10.1 g（相对分子质量为121.4），先加50 mL蒸馏水溶解，用物质的量浓度为2 mol/L的盐酸调至pH=8.0，再加下述药品。NaCl：8.76 g（相对分子质量58.44）EDTA：37.2 g（相对分子质量372.24）SDS：20 g（相对分子质量288.3）待上述药品全部溶解后，再用蒸馏水定溶至1000 mL。若在室温低于20时配制药液，SDS呈沉淀析出，此时需要加温，才能将SDS溶解。如果提前配制的研磨液出现了沉淀，则应加温使沉淀溶解后再使用。附2：研磨液中几种药品的作用SDS（十二烷基磺酸钠）：可使蛋白质变性，与DNA分离。EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：为DNA酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA。物质的量浓度为0.15 mol/L的氯化钠溶液：能很好地溶解DNA。Tris/HCl：提供缓冲体系，DNA在这个缓冲体系中呈稳定状态。（Tris为三羟甲基氨基甲烷）五、典型例题分析例1关于DNA在NaCl溶液中的溶解度，下面的叙述哪一个是正确的A.随着NaCl溶液浓度的增大，DNA在NaCl溶液中的溶解度也增大B.随着NaCl溶液浓度的减小，DNA在NaCl溶液中的溶解度也减小C.DNA在NaCl溶液中的溶解度与NaCl溶液的浓度无关D.当NaCl溶液的浓度为0.14 mol/L时，DNA的溶解度最低分析：核酸在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度变化而改变的。在浓NaCl（12 mol/L）溶液中，DNA的溶解度很大，RNA的溶解度很小，在稀NaCl（0.14 mol/L）溶液中，DNA的溶解度很小，RNA溶解度很大，因此，可利用不同浓度NaCl溶液，将DNA和RNA从样品中分别抽提出来。答案：D例2DNA的提取和鉴定实验中，提取鸡血细胞的细胞核物质和析出含DNA的黏稠物这两步中都用到了蒸馏水，其作用分别是A.防止鸡血细胞失水皱缩和稀释NaCl溶液至0.14 mol/LB.防止鸡血细胞失水皱缩和溶解DNAC.使鸡血细胞吸水胀破和稀释NaCl溶液至0.14 mol/LD.使鸡血细胞吸水胀破和溶解DNA分析：鸡血细胞在清水中会吸水膨胀而最终胀破，从而释放出核物质。植物细胞由于有细胞壁的限制，不会因大量吸水而胀破。DNA在NaCl溶液中的溶解度；是随着NaCl的浓度变化而改变的，在NaCl浓度为0.14 mol/L时，其溶解度最小，有利于DNA的析出。答案：C例3在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，将提取获得的含DNA的黏稠物（还含有较多杂质）分别处理如下：第一，放入0.14 mol/L的氯化钠溶液中，搅拌后过滤，得到滤液A和黏稠物a。第二，放入2 mol/L的氯化钠溶液中，搅拌后过滤，得滤液B和黏稠物b。第三，放入冷却的95%的酒精溶液中，搅拌后过滤，得滤液C和黏稠物c。以上过程获得的滤液和黏稠物中，因含DNA少而可以丢弃的是_。分析：在不同浓度的氯化钠溶液中，DNA的溶解度不同。在0.14 mol/L的氯化钠溶液中溶解度最小；DNA析出，呈丝状物，过滤后存在于黏稠物中；在2 mol/L 的氯化钠溶液中溶解度最大，所以DNA呈溶解状态，过滤后存在于滤液中；酒精溶液可使DNA分子凝集，因此，在冷却的95%的酒精溶液中DNA凝集，呈丝状物，过滤后，存在于黏稠物中。答案：A、b、C