几种常用生物活性测试方法简介.ppt

几种常用生物活性测试方法简介,CONTENTS,细胞水平活性测试方法,等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。,Isothermal Titration Calorimetry (ITC),基本原理：,注：H 为受体（主体），G为配体（客体），Ka为结合常数 Go为Gibbs自由能变化，Ho 为焓变，So 为熵变,受体-配体复合物的形成伴随着能量的释放或吸收，导致样品池温度的变化，参比池始终保持在实验温度，反馈系统提供热或降低热量来补偿样品池的温度变化，每注射一次后系统恢复至平衡状态再进行下一滴滴定。结果以峰的形式表示平衡温度偏移所需要的能量，峰的面积相当于反应释放或吸收的热量。,ITC仪结构示意图,Isothermal Titration Calorimetry (ITC),ITC是一种热量连续变化的量热器。主要由隔热夹套包裹着的样品池(反应池)和参比池、注射器和一台计算机组成，注射器同时具有搅拌作用，计算机控制温度控制装置和信息反馈系统。,Methods In Cell Biology, 2008, 84,79.,Isothermal Titration Calorimetry (ITC),ITC数据图,Journal of Molecular Recognition.2008, 21, 289.,左图： 横坐标：时间 纵坐标：热功率 峰底与峰尖之间的峰面积为每次注射时释放或吸收的总热量。 右图： 横坐标：滴定物与样品溶液的摩尔比 纵坐标：滴定产生的总热量 反应过程的结合等温曲线,ITC独特之处： 样品用量小，方法灵敏度和精确度高。最小可检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0.4ug，滴定池体积1.43 ml 实验时间较短。典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间。 操作简单。整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由软件分析ITC得到的数据。 量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。,ITC的用途： 获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数(Ka)、结合位点数(n)、摩尔结合焓(H）、摩尔结合熵（ S）、摩尔恒压热容（ Cp），和动力学参数(如酶活力（Kcat）、酶促反应米氏常数(Km) 。 可以应用于蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质折叠/去折叠、蛋白质-小分子相互作用、酶-抑制剂相互作用、酶促反应动力学、药物-DNA/RNA相互作用、RNA折叠、蛋白质-核酸相互作用、核酸-小分子相互作用、核酸-核酸相互作用、生物分子-细胞相互作用等方面。,Isothermal Titration Calorimetry (ITC),surface plasmon resonance , SPR,表面等离子共振（SPR）原理,消逝波：当入射光到达界面时并不是直接产生反射光，而是先透过光疏介质约一个波长的深度，再沿界面流动约半个波长再返回光密介质，透过光疏介质的波被称为消逝波。,等离子波：当金属受电磁干扰时，金属内部的电子密度分布会变得不均匀。因为库仑力的存在，电子不会在引力与斥力的平衡位置停下而向前运动一段距离，之后电子间存在的斥力会迫使已经聚集起来的电子再次离开该区域。由此会形成一种整个电子系统的集体震荡，而库仑力的存在使得这种集体震荡反复进行震荡，并以波的形式表现。,surface plasmon resonance , SPR,表面等离子共振原理,光在棱镜与金属膜表面上发生全反射现象时，会形成消逝波进入到光疏介质中与介质中存在一定的等离子波相遇时可能会发生共振。当消逝波与表面等离子波发生共振时，检测到的反射光强会大幅度地减弱。 SPR角：反射光完全消失的角。 SPR角随金属表面折射率变化而变化，而折射率的变化又与金属表面结合的分子质量成正比。 可通过 SPR 角的变化捕获生物反应过程中生物分子之间相互作用的特异信号，对待测物质进行测定直接测量反应平衡常数 Ka，解离平衡常数 Kd 等。,surface plasmon resonance , SPR,将待测分子键合在生物传感芯片表面，使其形成分子敏感膜， 再将分析物分子溶液注入，使其以恒定流速流过芯片表面，如果两者通过相互作用而结合，则将引起生物传感器表面质量的增加， 导致传感器表面折射率的变化，从而引起SPR角的改变。 SPR被广泛应用于分析生物分子如蛋白质-蛋白质、药物-蛋白质、蛋白质-核酸、核酸-核酸之间的相互作用，所涉及的研究领域包括免疫学、蛋白质组学及药物筛选等。,J.Pharmaceut.Biomedical.2008,11,28.,surface plasmon resonance , SPR,SPR的优点： 可以实时、连续监测反应的动态过程，灵敏度较高 。 可实时记录反应的结合与解离过程。 每次检测结束后，结合在金属膜芯片上的反应物可以用洗脱液洗脱使芯片再生，可重复使用，节约耗材。 可以得到高通量数据。,SPR的缺点： 待测物在金属薄膜表面的固定：由于生物大分子本身理化性质的复杂性，空间结构的特殊性，偶联结果可能导致偶联物特异作用位点的失活。 分析物在金属薄膜表面的结合：难以区分非特异性结合，若分析物在芯片表面是非特异性结合， 会给整个实验带来干扰，造成错误的结论。 待测物的分子大小：适用于生物大分子，小分子的质量变化对折射率变化不明显， 因此会给小分子待测物的检测造成困难。 动态范围过小：对温度、样品组成、金属薄膜要求高。,分子水平活性测试方法,SPR 与 ITC 功能特性对比,Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET),FRET原理,传统FRET技术容易受样品组分(缓冲液，蛋白，化学物质及细胞裂解产物等)背景荧光信号的影响。 时间分辨通过去除寿命较短的背景，分辨目的荧光。,通过使用供体和受体荧光团标记， TR-FRET 检测将时间分辨 (TR) 和荧光共振能量转移 (FRET) 原理的优势结合到了一起。,J. Biomol. Screen. 2015, 7,4.,镧系元素（铕Eu和铽Tb）半衰期长(us-ms)，将Eu纳入立体笼中，形成稳固复合体，笼收集光将能量转移到Eu上。,Eu永久性嵌合穴状口袋（非螯合作用）耐受性好，对温度，光强，PH，离子强度变化影响较小。不易受化学物质干扰，如EDTA，二价离子（Mg2+，Mn2+）等。 持续激活后没有光漂白现象,可以多次读数，从而进行动力学实验。 镧系元素的半衰期大于1毫秒，与普通荧光纳秒级的半衰期相差6个数量级。当延迟50微秒读数时，普通荧光的信号近似于零。检测的发射光中没有来自于激发波长的干扰。 J. Phys. Chem. C, 2008. 17, 112.,铕穴状化合物的激发和发射光谱,Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET),Stokes shift 300nm,Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET),J. Phys. Chem. C. 2013,112,6589.,When these two fluorophores are brought together by a biomolecular interaction, a portion of the energy captured by the Europium during excitation is released through fluorescence emission at 620 nm, while the remaining energy is transferred to the APC. This energy is then released by APC as specific fluorescence at 660 nm only via FRET with Europium.,General Format For FRET,Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET),J. Biomol. Screen. 2015, 7,4.,PD1-PDL1 binding assay,1.根据需要，使用1X BRD TR-FRET Assay Buffer分别将成分Eu-labeled donor 和 dye-labeled acceptor (带straptavidin标记） 100倍稀释； 2.向384孔板中，每孔加入稀释好的Eu-labeled donor 和dye-labeled acceptor 各2.5ul； 3.向每孔中加入一定量的化合物，阳性对照组加入对应体积的DMSO；振荡反应1min； 4 .根据需要，使用1X BRD TR-FRET Assay Buffer将组分BET Bromodomain 40倍稀释。分别向化合物检测组和阳性对照组加入稀释好的BET Bromodomain 2.5ul每孔； 5.根据需要，使用1X BRD TR-FRET Assay Buffer将组分acetylated Ligand1（带Biotin标记） 40倍稀释。向阴性对照组加入稀释好的BET Bromodomain 2.5ul每孔； 6. 每孔加入一定量的BRD4 bromodomain ，保证每个反应体系中含有4.5ng含量的酶。 7 .室温静置反应1h后，测值340/665nm。,Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET),BDR4相关化合物TR-FRET活性测试方法,BRD4(BD1)TR-FRET Assay Kit 购买自 BPS Bioscience 公司,(620/670nmCayman,enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA),可用于测定抗体，也可用于检测抗原。根据检测目的和操作步骤不同，有以下几种类型： 直接法 间接法 双抗体夹心法 竞争法,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 基本原理是先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。 用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。,enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA),直接法,（Direct ELISA）,间接法（Indirect ELISA）,将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本(含相应抗体)与之结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定。 检测抗体最常用的方法。,双抗夹心法（Sandwich ELISA）,enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA),将已知抗体吸附于固相载体加入待检标本(含相应抗原)与之结合。温育后洗涤，加入酶标抗体和底物进行测定。,（竞争法Competitive ELISA）,可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。 以测定抗原为例将持异性抗体吸附于固相载体；加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，使二者竞争与固相抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。,enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA),在ELISA法中，底物被酶裂解后，能生成可溶性有色产物，适合用分光光度计(酶标仪)测量光密度值，以定量测定样品中待测抗原或抗体的含量。,ELISA常用的酶及其底物,1. Integrin 61蛋白 5g/ml，50l/孔，4C固定过夜；（包被 Coating） 2. PBS 250l/孔 冲洗3次；（封闭 Blocking） 3. 加入上述多肽，其中CRWY-biotin 工作浓度为0.00005mol/L，体积为50l。阻断肽为0.0005mol/L，50l； 4. 室温结合1小时； 5. HEPES冲洗6次，250l/次； 6. 加入HRP- straptavidin 1：3000，室温1小时； 7. HEPES冲洗6次，250l/次； 8. 加入50l TMB，观察显色效果； 9. 加入100l 0.5M H2SO4终止反应，450nm测OD值。,enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA),ELISA测试CRWY修饰肽与整合素6的亲和力实验方法,竞争法,BAS-ELISA,CONTENTS,细胞水平活性测试方法,检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在540 或720nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。用于检测细胞增殖、细胞毒性。,MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐。商品名：噻唑蓝，是一种黄颜色的染料。,MTT,MTT,1.将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，,加入浓度梯度的药物, 一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔。 2.5%CO2，37孵育16-48小时。 3.每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。 4.终止培养，准备溶解结晶，测试吸光度。 第一种，DMSO溶解 MTT加入培养4h后，结晶可充分形成，将细胞上清去掉。 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。酶标仪测OD 570nm处测量各孔的吸光值。 第二种：三联溶解液 该方法细胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。（溶解液因含 有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。） 放入培养箱中继续孵育46小时，镜下观察，待结晶全部溶解后570nm测吸光度。,MTT一般操作方法,MTT的缺点： 由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响。 MTT有致癌性。 MTT对菌很敏感，配成的MTT需要无菌保存。 可靠度和灵敏度易受细胞容积、氧化还原剂、有色物质等因素干扰。,MTT,MTT的优点： 不涉及使用同位素； 使用试剂少，仪器简单，耗时少； 线性范围宽； 适用于大量抗癌药物的筛选。,Cell Counting Kit-8（CCK-8）,基本原理：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被活细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。,CCK8的优点： 使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂； CCK-8法能快速检测； CCK-8法的检测灵敏度很高，可以测定较低细胞密度； CCK-8法的重复性优于MTT 法； CCK-8法对细胞毒性小； CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。,Cell Counting Kit-8（CCK-8）,CCK8的缺点： 与MTT法相 比，CCK8的价格比较贵。 CCK8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。,1、各种癌细胞系按适宜的细胞浓度，50uL/孔体积铺板384孔板， 37培养过夜，处理。 2、化合物稀释: 先将化合物用DMSO溶解成10mM储存液，并用DMSO 3倍梯度稀释成10个浓度梯度，成1000化合物系列浓度储存液，再转移至化合物转移仪器适配384 PP板中备用。 3、利用化合物转移仪器Liquid Handler Echo520将1000系列浓度化合物转移至癌细胞384孔板的相应孔中，每孔50nL，空白对照孔加入50nL DMSO。轻柔混匀，37继续培养。 4、72小时后加入CCK8细胞增殖毒性检测试剂，3uL/孔，37孵育2小时。然后用酶标仪检测450nm光吸收强度。,Cell Counting Kit-8（CCK-8）,BDR4相关化合物抗癌细胞活性体外筛选方法,细胞水平活性测试方法,检测细胞增殖/毒性测试方法比较,Sulforhodamine B（SRB）,SRB（即磺酰罗丹明B， Sulforhodamine B）是一种粉红色阴离子染料，易溶于水，在酸性条件下可特异性地与细胞内组成蛋白质的碱性氨基酸结合;在515 nm波长下产生吸收峰，吸光值与活细胞数成线性正相关，故可用作细胞数的定量检测。,SRB法以其敏感、准确、特别适用于大规模药物筛选等优点,被美国国立癌研究所(NCI) 列为标准的抗癌筛选方法之一。,1)细胞固定:药物作用时间终点时，每孔加入50L4预冷的TCA溶液(30%，w/v)固定细胞，TCA溶液的终浓度为10%。静置5 min移入4冰箱中固定1 h，取出用去离子水冲洗5遍，室温晾干。 2)染色:待96孔板室温下晾干后，每孔加入0.4%(w/v)的SRB染液(1%的乙酸配制)70L，染色30 min后倒掉染液，用1%(v/v)乙酸冲洗4次，去除未结合的染料，室温晾干。 3)检测:用100L非缓冲Tris-base碱液(10mM，pH=10.5)溶解与细胞蛋白结合的染料，水平摇床上振荡20min，采用酶标仪540nm处测定光吸收值。,Sulforhodamine B（SRB）,SRB检测的一般操作步骤,MTT法操作简便、敏感 ,可重复性及信号 - 噪音比好。但 Formazan的生成受作用时间的影响 ,样品较多时测定的 OD值随时间而变 ,会增加实验误差。用Tris-base溶液溶解的SRB也可稳定较长时间。因此不同时间点固定的96孔细胞培养板可在同一时间测定，测定的吸光值结果不会受到明显影响。虽然SRB法比其他检测方法操作步骤繁琐，但是由于时间可以自己掌握，不受限制，因此适用于高通筛选。 SRB更适于测定悬浮细胞，用TCA能完全酸化固定细胞，较之MTT法吸去上清，不会带来细胞损失，测量结果更准确。,Sulforhodamine B（SRB）,SRB的优点,CONTENTS,细胞水平活性测试方法,总结,ELISA,MTT,生物活性测试方法,TR-FRET,ITC,SPR,总结,