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成才之路 生物,路漫漫其修远兮 吾将上下而求索,人教版 选修1,DNA和蛋白质技术,专题五,课题3 血红蛋白的提取与分离,专题五,1.掌握提取生物大分子的基本过程和方法。(重点) 2理解凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。(重、难点) 3尝试对血液中的血红蛋白进行提取和分离。,一、凝胶色谱法 1概念：也称做_，是根据_分离蛋白质的有效方法。 2原理 当_不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量_的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程_，移动速度_，而相对分子质量_的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在_移动，路程_，移动速度_，从而使_不同的蛋白质分子得以分离。,分配色谱法,相对分子质量大小,相对分子质量,较小,较大,较慢,较大,凝胶外部,短,快,相对分子质量,二、缓冲溶液 1作用：在一定范围内，抵制_的_对溶液pH的影响，维持pH_。 2配制：由_种缓冲剂溶解于_中配制而成，通过调节缓冲剂的_就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。,外界,酸和碱,相对稳定,12,水,使用比例,三、电泳 1概念：指_在电场的作用下发生的_的过程。 2原理：在一定的_下，_、_等生物大分子的可解离基团会带上_或_，在_的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷_的电极移动。,带电粒子,迁移,pH,多肽,核酸,正电,负电,电场,相反,3作用：电泳利用了待分离样品中各种分子_的差异及分子本身的_、_的不同，使带电分子产生不同的_，从而实现样品中_的分离。 4方法：常用的电泳方法有_和_。测定蛋白质分子量时通常使用_。,带电性质,大小,形状,迁移速度,各种分子,琼脂糖凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胺电泳,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,四、实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步：_、_、_和_。 1样品处理 (1)红细胞的洗涤：目的是_。采用_离心，吸取血浆后加_洗涤，直至上清液中没有_，表明红细胞已洗涤干净。 (2)血红蛋白的释放：在_和_的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。,样品处理,粗分离,纯化,纯度鉴定,去除杂蛋白,低速短时间,生理盐水,黄色,蒸馏水,甲苯,(3)分离血红蛋白溶液：把混合液离心后，将试管中的液体用滤纸过滤，除去_，于分液漏斗中静置片刻后，分离出下层的_。 (4)透析：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。,脂溶性沉淀层,红色透明液体,2凝胶色谱操作 (1)凝胶色谱柱的制作：准备材料加工橡皮塞安装色谱柱。 (2)凝胶色谱柱的装填。 (3)样品的加入和洗脱。其基本过程是调节缓冲液面加入蛋白质样品调节缓冲液面洗脱收集分装蛋白质。至此，血红蛋白即可得到粗分离。 3纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是_。,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,五、操作提示 1红细胞的洗涤：_、_与_十分重要。洗涤次数过少，无法除去_；离心速度_和时间_会使_等一同沉淀，达不到分离效果。 2色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在_中膨胀，可以将加入其中的湿凝胶用_，加速膨胀。 3凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不能有_存在。因其能搅乱洗脱液中蛋白质的_，降低分离效果。 4蛋白质的分离：如果_，说明色谱柱制作成功。,洗涤次数,离心速度,离心时间,血浆蛋白,过高,过长,白细胞,洗脱液,沸水浴加热,气泡,洗脱次序,红色区带均匀一致地移动,红细胞破碎后混合液中含有什么成分？ 红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯等。,教材P70“旁栏思考题” 凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。,如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，从而影响分离的效果。,(一)依据蛋白质的特性的差异 蛋白质的理化性质(如形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等)千差万别，由此可提取和分离各种蛋白质。,血红蛋白提取和分离的方法,(二)蛋白质的分离方法：凝胶色谱法 1概念：凝胶色谱法也称做分配色谱法，是根据相对分子质量大小分离蛋白质的有效方法。 2原理：大多数凝胶由糖类化合物构成的小球体，内部有许多贯穿的通道，当不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长移动速度较慢；而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。,(三)缓冲溶液 1作用：在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。 2配制：通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。,(四)电泳 1概念：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。 2原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定pH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。,电泳利用了除哪些性质外使样品中各种分子分离( ) A带电性质差异 B分子的大小 C分子的形状 D分子的变性温度 解析 电泳是指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程，带电性质不同、分子的大小和形状不同都会影响带电粒子在电场中的迁移速度。 答案 D,导学号 06350412,利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来( ) A相对分子质量大的 B溶解度高的 C相对分子质量小的 D所带电荷多的 答案 A 解析 凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量大的蛋白质，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。,导学号 06350413,蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。,提取和分离血红蛋白的实验操作,(二)凝胶色谱操作的主要步骤,3纯度鉴定SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定的方法中，使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。,4结果分析与评价,蛋白质提取和分离分为哪几步( ) A样品处理、凝胶色谱操作、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 B样品处理、凝胶色谱操作、纯化 C样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定 D样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定 解析 蛋白质的提取和分离分为样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定四步。A中凝胶色谱操作及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳为实验操作过程中的技术。 答案 C,导学号 06350414,相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程，可表示为下图中哪一个( ) 答案 B,导学号 06350415,解析 本题考查对凝胶色谱法分离蛋白质原理的理解，蛋白质相对分子质量越大，越容易通过凝胶间隙而先被洗脱，蛋白质相对分子质量越小则易进入凝胶内部而后被洗脱。,一、蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析 特别提示：凝胶色谱的原理是相对分子质量小的蛋白质进入凝胶孔道，路程长，移动速度慢；而相对分子质量大的蛋白质在凝胶外部移动，路程短，移动快，这种现象又称分子筛效应。,二、样品处理、分离与纯化的目的不同,答案 较慢 较快 pH 带电性质 凝胶色谱法,
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