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,五倍子体外抑菌实验研究,1,前言 仪器与材料 实验方法 技术路线 步骤 结果与结论 讨论,目录,2,五倍子(Galla chinensis),别名文蛤、百虫仓、木附子等, 五倍子为漆树科植物盐肤木、青麸杨或红麸杨叶上的虫瘿，主要由五倍子蚜寄生而形成。秋季采摘，置沸水中略煮或蒸至表面呈灰色，杀死蚜虫，取出，干燥。按外形不同，分为肚倍和角倍。作为传统中药,始载于开宝本草,具有敛肺降火、涩肠止泻、固精缩尿、止汗、止血、解毒、敛疮等多种临床功效。五倍子主产于四川、贵州、云南、陕西、甘肃、湖北、广西、湖南、河北、山西、广东、安徽、福建、浙江、江西等地。现选择云南、陕西、湖南、河北、浙江五省五倍子进行抑菌实验研究，旨在观察不同地区五倍子抑菌效果。,前言:,3,4,仪器与材料：,金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、绿脓杆菌均来源于宁夏医科大学检验学院；MH培养基培养基及琼脂购于杭州天和微生物试剂有限公司。 恒温摇床（HS-200B，上海和呈）无菌操作台（苏净集团）超控超声波清洗器（KQ-500DA型;昆山市超声仪器有限公司）；电热鼓风干燥箱（DHG-9075A型;上海-恒科学仪器有限公司）；旋转蒸发仪（R206;上海申升科技有限公司）；立式压力蒸汽灭菌器（LDZX-50KBS;上海申安医疗器械厂）；冰箱,5,方法:,2.1实验药液的制备 分别称取各产地五倍子粉末25g（过10目筛）于相应烧杯中，各量取70%的乙醇溶液250ml加入烧杯，超声提取30min后分别用两层纱布初步过滤后将滤液再次抽滤，滤渣再次提取合并两次滤液，最后用旋转蒸发仪浓缩后将浓缩后的药液用25ml容量瓶定容放于冰箱保存备用。 2.2抑菌实验 2.2.1菌液培养： 实验前所有试管培养皿锥形瓶等在高压蒸汽灭菌锅（121，0.12MP）内经过高温消毒。取4支高温灭菌好的试管贴好标签，分别加入3ml双料MH培养液后各刮取一个菌落至相应试管中，放于37恒温摇床（60w/min）培养1618h使这些菌种进行活化使细菌有较强的活力。取4支试管各加入6ml单料培养基贴好标签加2.2.2入60ul上述培养好的菌液于相应试管中放入37恒温摇床（60w/min）培养46h将菌液保存于冰箱内备用。,6,方法:,2.2.2 不同浓度药液培养液培养细菌： 取202支在高压蒸汽灭菌锅内灭过菌的试管贴好标签，加入相应倍半稀释法稀释好的药液各1ml，加入相应菌液100ul，放入恒温摇床培养1618h。 2.2.3琼脂平板制备： 按说明书配置足量营养琼脂，配好后经高压灭菌，待温度稍降低在无菌操作台内将营养琼脂倒入灭好菌的培养皿制备琼脂平板备用。 2.2.4抑菌效果检测： 由于药液本身有一定的浑浊度无法准确观察细菌生长状况所以将菌液涂琼脂平板内培养取52个高压灭菌好的琼脂平板，在琼脂平板上划线将琼脂平板平均划分为四个区编号，将三中各试管药液用接种环接种支琼脂平板，放入摇床培养1618h，最后观察实验结果并记录最小抑菌浓度。,7,技术路线：,8,步骤：,（一）提取： 分别称取个产地五倍子粉末25g（过10目筛）于相应烧杯中 各量取70%的乙醇溶液200ml加入烧杯 超声提取30min 分别用两层纱布初步过滤后将滤液再次抽滤的滤液 重复2-4部操作 合并两次滤液后用旋转蒸发仪浓缩放于冰箱保存备用 将浓缩后的药液用25ml容量瓶定容备用 （二）抑菌实验： （）实验前准备： 按个培养基说明配置适量营养液 将营养液、试管、培养皿、锥形瓶等试剂仪器高压灭菌备用 （）菌液培养： 取4支试管贴好标签后分别加入3ml培养液 各刮取一个菌落至相应试管 放于摇床培养1618h,9,取4支试管各加入6ML单聊培养基贴好标签加入60ul培养好的菌液于相应试管中 放入摇床培养46h 将菌液保存于冰箱内备用 （）不同浓度药液培养液培养细菌： a. 取202支灭过菌的试管贴好标签 b加入相应稀释好的药液 c.加入相应菌液100ul d. 放入摇床培养1618h （）琼脂平板制备： a. 按说明书配置一定量营养琼脂 b. 高压灭菌 c. 待温度稍降低将营养琼脂倒入灭过菌的培养皿注意正规操作 （）抑菌效果检测： a. 取52个四中制好的琼脂平板平均分为四个区编号 b. 将三中各试管药液用接种环接种支琼脂平板 c. 放入摇床培养1618h d. 观察实验结果并记录,10,为测定不同产地五倍子抑菌效果选取云南、陕西、河南、湖南、浙江五个产地。将所提取药液用倍半稀释法配置成250ug/ml、125ug/ml、62.5ug/ml、31.25ug/ml、15.625ug/ml七种浓度。不同产地五倍子提取物对四种细菌的最小抑菌浓度如下表：,结果与结论,11,结果与结论,12,五倍子中的主要有效成分为鞣质,我国药典上收载的五倍子鞣质,称为鞣酸(tannic acid),又叫单宁酸。它是倍酰葡萄糖的混合物,即葡萄糖上的羟基与没食子酸所形成的酯类化合物的混合物,属水解类鞣质。五倍子鞭质能够与蛋白质发生结合，生成靴质蛋白，对细菌有直接的杀灭作用。本实验结果表明云南省五倍子提取物的抑菌效果明显比另外四个省的抑菌效果好。,结果与结论,13,谢谢各位评委、老师、同学观看！,14,
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