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DBS 53云南省食品安全地方标准DBS 53/ 0162013食品中展青霉素的测定液相色谱-串联质谱法2013 - 10 - 20发布2014 - 04 - 20实施云南省卫生厅发布DB53/ 0162013前言本标准为首次发布。6食品中展青霉素的测定 液相色谱-串联质谱法1 范围本标准适用于食品（果汁饮料、果酒、果酱、果干及薯类制品等）中展青霉素的测定和确证。2 规范性引用文件本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。3 原理 澄清液体样品（果酒样品需出去乙醇）直接固相萃取净化；混浊液体样品和固体样品先用果胶酶水解，再以乙酸乙酯提取，吹干浓缩后固相萃取净化，液相色谱-质谱/质谱法测定，外标法定量。4 试剂除另有说明外，所用试剂均为分析纯，试验用水为GB/T 6682规定的一级水。4.1 乙腈（色谱纯）。4.2 甲醇（色谱纯）。4.3 冰乙酸。4.4 乙酸乙酯（色谱纯）。4.5 果胶酶溶液：活度不低于1300 U/mL（果胶酶固体则需按活度配制为溶液）。4.6 0.2%乙酸溶液：量取2 mL冰乙酸以水定容于1000 mL容量瓶。4.7 展青霉素标准品（patulin）：CAS编号149-29-1，纯度大于99.0%。4.8 展青霉素标准储备溶液：准确称取适量的展青霉素标准品，用乙酸乙酯配成200 g/mL的标准储备溶液，避光于-18下保存，稳定期1个月。4.9 展青霉素标准中间溶液：准确移取适量的展青霉素标准储备溶液，用氮气吹干后，用0.2%乙酸（4.7）配成2 g/mL的标准中间溶液，避光于4下保存，即用即配。4.10 标准工作溶液：以相应的空白样品为基质，加入相应浓度的标准中间液，配制成1.0g/L、5.0g/L、10.0g/L、50.0g/L、100.0g/L标准溶液，同样品一同进行前处理及上机检测，并绘制标准曲线。4.11 固相萃取小柱：Osais HLB或相当者，3 mL/60 mg。使用前对固相萃取柱依次加入3 mL水、3 mL甲醇和3 mL水活化，流速控制在每秒2滴3滴。5 仪器5.1 液相色谱串联四级杆质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）。5.2 电子天平：感量0.1 mg，感量0.01 g。5.3 漩涡混匀器。5.4 高速离心机。5.5 搅拌式均质机。5.6 氮气吹干仪。5.7 恒温空气浴（水浴）振荡器。6 分析步骤6.1 试样处理6.1.1 澄清液体样品 取2 g试样（精确到0.01 g）于已活化的固相萃取柱上，用2 mL乙酸溶液（4.6）淋洗，流速为每秒1滴，抽真空3 min5 min，然后加入乙酸乙酯（4.4）溶液洗脱，收集洗脱液于氮气下常温吹干，用1 mL乙酸溶液（4.6）溶解定容，供液相色谱-质谱/质谱联用仪测定。6.1.2 浓缩果汁、果酱等浑浊试样取4 g试样（精确到0.01 g）于一具塞离心管中，加入20 mL水以均质机充分均质，再加入200 L果胶酶溶液（4.5）混匀，30空气浴（或水浴）条件下避光摇震过夜，在酶解后的溶液中加入20 mL乙酸乙酯，漩涡提取3 min，于4000 r/min离心5 min，转移上层乙酸乙酯提取液，再用20 mL乙酸乙酯重复提取一次。合并两次乙酸乙酯提取液，过无水硫酸钠后，取20 mL氮吹浓缩至干，用2 mL乙酸溶液（4.6）溶解残渣并定容。净化过程同6.1.1。6.1.3 固体样品取100 g样品进行粉碎后取4 g试样（精确到0.01 g）于一具塞离心管中。其余步骤同6.1.2。 6.2 测定6.2.1 液相色谱参考条件a) 色谱柱：C18填料，规格：100 mm2.0 mm3.0 m或相当者；b) 流动相：流动相为水和甲醇，流动相梯度见表1。c) 流速：0.4 mL/min；d) 柱温：25；e) 进样量：5 L。表1 流动相的梯度洗脱程序时间/min0.01.03.04.04.16乙腈/%1010606010106.2.2 质谱条件a) 离子化模式：展青霉素电喷雾电离为负离子模式（ESI-）。b) 质谱扫描方式：多反应监测（MRM）。c) 其他质谱条件参见附录A。6.3 液相色谱-质谱/质谱测定6.3.1 定量测定根据样液中展青霉素浓度，选定峰面积相近的标准工作溶液，标准工作溶液及样液中展青霉素响应值应在仪器检测线性范围内。在上述仪器条件下，展青霉素参考保留时间约3.18 min。标准溶液的液相色谱-质谱/质谱多反应监测谱图参见附录B中图B.1。6.3.2 定性测定按照上述仪器条件测定样品和标准工作溶液，如果样品的质量色谱峰对保留时间与标准溶液在2.5%范围内；定性离子对的相对丰度与浓度相当的混合基质标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表2的规定，则可判定样品中存在相应的被测物。表2 定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度/%502050102010允许的相对偏差/%202530506.4 检出限本方法的测定低限：展青霉素为5 g/kg。7 结果计算结果按式(1)计算：(1)式中：X试样中展青霉素含量，单位为微克每千克（g/kg）；c从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V 定容体积，单位为毫升（mL）；m 试样溶液所代表试样的质量，单位为克（g）。8 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对值不得超过算术平均值的10。AA附录A （资料性附录）展青霉素参考质谱条件表A.1 展青霉素参考质谱条件质谱条件展青霉素152.9/108.9a152.9/81.0b喷雾电压IS/eV-4500气帘气CUR/MPa10.0碰撞气CAD/MPa5去溶剂温度TEM/600雾化气GS1/MPa50.0去溶剂气流GS2/MPa50.0去簇电压DP/eV-20.0碰撞能量CE/eV-13-20碰撞室出口电压CXP/eV-2.0-2.0注：对于不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。a离子为定量离子。b离子为定性离子。BB附录B （资料性附录）展青霉素标准品的总离子流图和二级质谱图.0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.5Time, min0.02000.04000.06000.08000.01.0e41.4e41.6e41.8e4Intensity, cps3.181.2e4图B.1 展青霉素标准品的总离子流图5060708090100110120130140150160m/z, Da0.05.0e61.0e71.5e72.0e72.5e73.0e73.5e74.0e74.5e75.0e7Intensity, cps81.0108.9153.082.978.953.0135.069.0107.0124.965.055.0图B.2 展青霉素标准品的二级质谱图（母离子：m/z 152.9）_
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