实验1 大肠杆菌的培养与分离

.实验1：大肠杆菌的培养和分离一、教学要求基本要求1进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作2进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基本进行细菌的划线培养。 发展要求说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。说明 二、基本内容微生物的实验室培养培养基无菌技术分离、纯化大肠杆菌培养基的配制配制培养基的原则配制培养基的方法计算称量溶化调pH分装加棉塞灭菌倒平板平板划线法稀释涂布法系列稀释平板涂布1培养基的种类和化学成份培养基的种类有很多划分标准，按物理性质分：固体培养基和液体培养基（加入琼脂多少）。液体培养基用于扩大培养和工业生产，固体培养基用于菌种分离，鉴定，计数（菌落数量）。培养基的化学成分包括 水 、 无机盐 、 碳源 、 氮源 、生长因子等。按照微生物的同化作用类型是自养还是异养，碳源不同，自养微生物为无机碳源，如硝化细菌是二氧化碳或碳酸盐，异养微生物为有机碳源，如大肠杆菌是葡萄糖等有机物。2常见微生物类群原核生物（如细菌大肠杆菌二分裂、革兰氏阴性、异养兼性厌氧性肠道杆菌、蓝藻、支原体、衣原体、放线菌等）、原生生物（草履虫、变形虫等）、真菌（酵母菌出芽生殖.异养兼性厌氧性微生物、霉菌、食用菌）、病毒等。细菌是单细胞的原核生物，有细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，无成型的细胞核，只有一环状DNA分子（拟核）。以分裂（二分裂）的方式繁殖，分裂速度很快。用革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性菌（革兰氏染液染色后，再脱色处理，细菌仍保留染色液的颜色）和革兰氏阴性菌两大类，区别在细胞壁的成分不同。大肠杆菌是革兰氏阴性（细胞壁薄，有荚膜）、兼性厌氧的肠道杆菌。3无菌技术对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行；避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。比较理化因素的作用强度消灭微生物的数量芽孢和孢子能否被消灭消毒较为温和部分生活状态的微生物不能灭菌强烈全部微生物能灭菌方法：接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法。玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱。 培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅。表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。4培养基的配制原则目的要明确：根据培养的微生物种类、培养的目的等确定培养基的类型和配制量。营养要协调：培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜。pH要适宜：细菌培养基pH中性或偏碱性，霉菌培养基呈酸性。5实验操作步骤（1）配制培养基：计算称量溶化调pH分装加棉塞灭菌倒平板（形成斜面是为增大接种面积）。我们一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后可在LB固体培养基上划线分离。以下为本实验中培养基配置步骤： 称量：准确称取各成分。蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠0.5g，加水50ml。配置LB固体培养基时还需加1g琼脂。 溶化：加热熔化，用蒸馏水定容到50mL。配置LB固体培养基时还需加琼脂，整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。 调pH：用1mol/L NaOH溶液调节pH至偏碱性。 灭菌：在两个250ml的三角瓶中分别装入50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养基，加上棉塞。将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅内，1kg压力灭菌15min。 倒平板：灭菌后，待固体培养基冷却至60左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其过程是：将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通过火焰；用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖；待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。 倒过来放置的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。向培养皿中转移已灭菌的培养基时，也不要把培养基沾在皿壁上。否则，空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。 （2）接种微生物接种的最常用方法是平板划线法和稀释涂布法。平板划线法（方法简单，考试的主要考查点）：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面（也是分离纯化的方法）。在第一次划线后都从上次划线末端开始的目的是获得由单个细菌形成的标准菌落。稀释涂布平板法（操作复杂，单菌落更易分开）：将菌液进行一系列梯度稀释，并将不同稀释度菌液分别涂布到琼脂固体培养基上进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌形成的标准菌落。1划线分离法：用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线过程中菌液逐渐减少，细菌也逐渐减少。划线到最后，可使细菌间的距离加大。在培养1020h后，可由一个细菌产生单菌落，菌落不会重叠。如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上，在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。 其操作步骤是：将培养皿底部用拇指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁取少许菌悬液，迅速送入培养皿内，在平板培养基的一边，作第1次平行划线 35条，转动培养皿约70角，用烧过冷却的接种针，通过第1次划线部分作第2次平行划线，然后再用同样方法，通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线时，接种针应与平板表面成30角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于恒温箱培养。 取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物；除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，其目的是防止高温杀死菌种；最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。 2涂布分离法：先将培养的菌液稀释，通常稀释到105 107之间，然后取0.1ml不同稀释度的稀释菌液放在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。通常每个培养皿有20个以内的单菌落最为适合。将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后，再做功能性实验。 （3）培养平板倒置放在培养箱中培养是为了使水分蒸发形成的水蒸气凝结成的水滴滴留在盖上，同时防止水滴入培养基并扩散开，已形成的菌落随水扩散，相互影响。（4）观察结果（菌落数量、特征等）并分析、评价1.微生物是指结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物，包括病毒、原核生物、原生生物和某些真菌。细菌是单细胞的原核生物，有细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，无成型的细胞核，只有一环状DNA分子（拟核）。以分裂（二分裂）的方式繁殖，分裂速度很快。用革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性菌（革兰氏染液染色后，再脱色处理，细菌仍保留染色液的颜色）和革兰氏阴性菌两大类，区别在细胞壁的成分不同。大肠杆菌是革兰氏阴性（细胞壁薄，有荚膜）、兼性厌氧的肠道杆菌。2.细菌的分离方法有两种：划线分离法和涂布分离法。是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。划线分离就是用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线的过程中菌液逐渐减少，细菌也逐渐减少，。划线最后，可使细菌间的距离加大。将接种后的固体培养基培养1020小时后，一个细菌细胞就会繁殖成许多细菌细胞，形成菌落，不会重叠。在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是有一个细菌产生的后代。用于基因工程的大肠杆菌的工程菌，可以用划线分离法获得产物表达能力高的菌株。由于工程菌的质粒中通常有抗性基因（如抗氨苄青霉素基因），如在培养基中加入一定量的氨苄青霉素，由于非工程菌的其他杂菌都没有抗性基因，所以在划线后只有存在抗性基因的工程菌能生存下来。涂布分离时，需要先将培养的菌液稀释，通常稀释到10-510-7之间，然后去0.1ml不同稀释度的稀释菌液放在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。通常每个培养皿中有20个以内的单菌落为最合适。将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后，再做功能性实验。划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂。3.在培养微生物时，必须进行无菌操作。其首要条件是各种器皿必须是无菌的，各种培养基也必须是无菌的，转移培养基、倒平板、接种、平板划线、平板稀释涂布等操作中的每一步都要做到无菌（防止杂菌污染）。进行恒温培养时，要将培养皿倒置，是因为培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿会使水蒸气凝结成水滴后，落入培养基的表面并且扩散，菌落中的细菌也会随水扩散，菌落见相互影响，很难在分成单菌落，达不到分离的目的。4.细菌扩大培养要用LB液体培养基（通用培养基、常用于做生理学研究和发酵工业），划线分离要用LB固体培养基（常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存）。“细菌喜荤，霉菌喜素”，通常细菌培养基要用蛋白胨和酵母提取物来配制，还要加入一定的氯化钠，以维持一定的渗透压；霉菌培养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可。尽管培养基的配方各不相同，但其基本成分都一样（五类）。人及动物的营养物质：水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类；植物的营养物质：矿质元素、水、二氧化碳等三类；微生物的营养物质：水、无机盐、碳源、氮源及生长因子等五类。4.无菌技术（1）获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几个方面：对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。（2）消毒与灭菌的区别消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法，还有化学药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、红外线消毒。灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。5.培养基（1）培养基可分为液体培养基和固体培养基（按照物理性质）。在液体培养基中加入凝固剂琼脂后，制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。根据菌落的特征可以判断是哪一种菌。（2）各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐四种营养物质。满足微生物生长还需要适宜的pH、氧气的要求（根据微生物的需求提供有氧或无氧环境）、特殊营养物质等。碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、蛋白质、脂肪等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N2、NH3、NO3-、蛋白质、氨基酸等。只有固氮微生物才能利用N2。（3）培养基配制的原则：目的要明确、PH值要适宜、营养要协调和要经济节约。实验2 分离以尿素为氮源的微生物尿素又称脲,是蛋白质的降解产物,哺乳动物的尿液中含有,植物不能直接吸收尿素,因此,大量尿素的存在对环境造成污染.有些细菌可产生脲酶,以尿素为氮源,脲酶可将尿素分解为氨,被植物吸收.1、 实验原理用选择培养基可分离出以尿素为氮源的微生物，这些微生物可产生脲酶，脲酶可将尿素分解为能被植物吸收的氨，因此这类微生物具有一定的生态学价值。稀释涂布平板法统计土壤样品中含有的这种微生物的数目细菌 尿素 NH3 中性 碱性 酚红颜色： 黄色 紫红色二、实验目的: 1.使用以尿素为唯一氮源的培养基分离细菌(有脲酶) 2.通过指示剂（酚红）颜色的变化检知培养基pH的变化(脲酶催化的化学反应) 3.统计被检测的土壤中含有的以尿素为氮源的微生物的数量3、 实验中涉及到的一些问题：（1） 哪些土壤中含有这种以尿素为氮源的微生物多？（选材的问题） 没硬化，腐殖质丰富的土壤 (二)此实验用到的选择培养基必需含有哪些物质？ 碳源、尿素、无机盐、水、酚红（3） 可用什么指标认定不同土壤中选择出的微生物对尿素分解能力的高低？ 培养基红色的深浅（四）统计微生物的数量可用哪些方法？ 稀释涂布平板法，显微镜直接记数法三、实验中涉及到的一些问题：（五）用稀释涂布平板法计数时，菌落数在30-300（20以内）计数。 做一系列浓度梯度实验，探究合适的稀释度 在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性 （六）实验设计要遵循的原则： 重复性原则 对照原则（排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验的可信度）四、实验用品和材料：五、操作步骤：、制备无菌的固体培养基和尿素固体培养基配制培养基LB培养基（1L） 蛋白胨： 10g 酵母粉： 5g NaCl： 10g 琼脂： 20g 实验组 对照组 尿素培养基（1L） 葡萄糖 10g NaCl 4.8g K2HPO4 4.8g 琼脂 20g 酚红 0.01g 尿素 80g、 倒平板：倒个培养基，个尿素固体培养基、 制备一定浓度梯度的细菌悬液：g土壤ml无菌水，振荡，为稀释液，依次制备、的土壤稀释液。、稀释涂布分离法分离细菌：（无菌，0.1ml，玻璃刮刀）、培养观察（倒置，度）应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。.