消毒剂消毒效果的验证报告

消毒剂消毒效果的验证 组长：* 组员：* * * * * * * * * 编号： 201412151135 版次： 2014 年 第 1 版 . . 目录 1概述 .3 1.1 消毒剂 .3 1.2 消毒剂使用说明 .3 2验证目的 .3 3验证内容 .4 4验证组织 .4 4.1 验证小组 .4 4.2 验证委员会 .4 5验证实施步骤 .5 5.1 验证前准备 .5 5.2 验证所需文件资料 .5 5.3 悬液法定量杀灭试验 .6 5.4 对裸手消毒效果试验 .7 5.5 消毒剂对佩戴手套后的消毒效果验证 .9 5.6 消毒剂对物体表面消毒效果验证 .11 5.7 消毒剂消毒效果验证结论 .15 6验证主要依据 .15 7验证合格标准 .15 7.1 判断标准 .15 7.2 现场考察试验合格标准 .15 8. 再验证周期 .15 附录 .16 附录一 验证方案会审记录 .16 附录二 验证方案修改申请及批准书 .17 附录三 漏项和偏差处理记录 .18 附录四 悬液法定量杀灭试验记录 .19 附录五 消毒剂对佩戴手套后人员手现场试验记录 .22 . . 1概述 1.1 消毒剂 消毒剂的作用原理：破坏细胞膜类，阻断细胞食物摄取和废物排泄，钝化关键酶。以 下是几种常用的消毒剂： （1）新洁尔灭(苯扎溴铵)：是一种常用的季铵盐类消毒剂，在浓度较低时即可有抑菌 的作用；当浓度较高时，可以杀灭多种细菌繁殖体和部分的病毒，但是不能杀灭细菌芽孢， 属于低效消毒剂。 （2）75%乙醇：适用于一般物体表面消毒以及手和皮肤的消毒，它无法杀灭细菌芽孢 和病毒。 （3）优洁：属于长效、强效、广谱杀菌剂，是一种新型消毒剂，其有效成分为复合季 铵盐和六亚甲基四胺，可有效快速地杀灭细菌繁殖体、芽孢、真菌和部分病毒等，各种微 生物对其均无抗药性，抑菌时间较长，可用于一般物体表面消毒，稳定性好，无腐蚀性， 无毒无害，并且由于杀菌时不受蛋白质及有机物的干扰，故使用衰减周期长，可循环使用， 相对使用成本低。 本次验证以优洁消毒剂的杀灭效果为主，同时也可根据此验证方案对 75%乙醇、新洁 尔灭等消毒剂的杀灭效果进行评价。 1.2 消毒剂使用说明 对于不同的消毒对象，应使用不同的消毒剂，并制订消毒程序，消毒程序中应明确规 定： （1）消毒剂的浓度及配制方法； （2）消毒剂使用的条件； （3）消毒使用的设备、设施； （4）消毒操作的详细步骤； （5）消毒周期； （5）消毒效果的监测方法。 制订的消毒程序的消毒效果应经过验证后，才能批准使用。 本验证具体规定了评价消毒剂消毒效力的生物学检测方法及其效果评价方法。 2验证目的 药品在生产过程中会遭到来自微生物的污染，因此必须要采取一定措施使微生物污染 处于受控状态或者完全被消除，这就需要对消毒剂消毒效果进行验证以确定相应的方案来 处理这些问题。在对消毒剂进行消毒效果验证的过程中，主要是要用特定的微生物与消毒 剂在规定的使用浓度下接触规定的时间后，对微生物进行培养计数，考察该消毒剂的消毒 效果，确定消毒剂消毒后的最长有效时间，并对消毒剂对微生物的杀灭效果进行评价。 确认洁净区按照规定的清洁、消毒程序进行清洁消毒后，能够达到防止交叉污染的目 . . 的，并在消毒有效期内能确保达到生产工艺所需要的效果。 本次验证以优洁消毒剂的杀灭效果为主，同时也可根据此验证方案对75%乙醇、新洁 尔灭等消毒剂的杀灭效果进行评价。 3验证内容 消毒剂消毒效果验证包括两项考察：实验室考察和现场考察。实验室考察通常以悬液 定量法为主，且试验须重复3次，而现场考察可用来评估消毒剂对相应设施的实际消毒效果。 在消毒剂消毒效果试验中，消毒方法和消毒对象有很多。常用的方法有：喷洒法，浸 泡法，擦拭法等。常见的对象有：皮肤，洁净区的地面、墙面，设备表面等。此次试验我 们采用的消毒方法为喷洒法，消毒对象为人员裸手皮肤、人员佩戴无菌手套后的手套表面 和物体表面。 根据消毒对象所制定相应的试验方案有：悬液法定量杀灭试验、消毒剂对裸手消毒现 场试验、载体喷雾定量杀菌试验、消毒剂对佩戴手套后的手消毒现场试验以及消毒剂对物 体表面现场鉴定试验。通过以上几种试验来对消毒剂消毒的效果进行验证。 4验证组织 4.1 验证小组 表 4-1 验证小组及职责 人员 部 门 职 务 职 责 组 长 质保部 部门负责人 （1）负责成立验证小组，明确各验证成员职责 （2）负责组织起草验证方案、验证记录和验证报告 （3）负责验证方案、验证记录和验证报告的审核工作 验证管理员 （1）负责起草验证方案 （2）负责对试验结果进行统计分析 （3）负责起草验证报告质保部 质保员 （1）负责现场取样（2）负责验证过程在线监督 质检部 部门经理 （1）负责组织对样品的检验（2）负责验证所需试剂、试液等的准备。 质检部 质检员 （1）负责样品的检验（2）负责检验数据的收集、整理。 部门经理 负责组织现场操作，确保验证按进度进行。 卫生员 负责消毒液的配制和发放。生产部 各工序 操作人员 （1）负责洁净厂房的清洁 （2）负责按消毒程序进行消毒。 组 员 设备部 部门经理 （1）负责仪器、仪表、量具的校正 （2）负责验证所用仪器、设备的安装、调试，并做好相应的记录 （3）负责纯化水的供给。 . . 4.2 验证委员会 4.2.1人员组成：由企业质量副总、生产副总及生产部、质量保证部、质量检验部、设备动 力部经理或主管组成。 4.2.2职责： 负责验证方案的审批； 负责验证的协调工作，以保证验证方案的顺利实施； 负责验证数据及结果的审核； 负责验证报告的审核； 负责确定该项验证的再验证周期； 负责验证证书的发放。 5验证实施步骤 5.1 验证前准备 在进行消毒剂消毒效果验证前，洁净厂房空气净化系统应经验证合格并正常运行，设 备动力部应提供洁净厂房空气净化系统的验证报告、空气净化系统操作程序；与验证相关 的各种设备、仪器均需通过相应验证，所需仪表、计量器具均需校验合格并具备校验证书。 5.2 验证所需文件资料 表5-1 验证所需的文件资料及存放处 资料名称 编号 存放处 活菌数检测操作规程 ZL-03-066 GMP 办公室 菌落计数操作规程 ZL-03-070 GMP 办公室 培养基配制操作规程 ZL-03-073 GMP 办公室 培养基配制、使用管理规程 ZL-03-110 GMP 办公室 消毒剂配制操作规程 WS-04-029 GMP 办公室 消毒剂的使用操作规程 WS-04-030 GMP 办公室 致病菌阳性菌株传代操作规程 ZL-03-075 GMP 办公室 实验器具清洗操作规程 ZL-03-087 GMP 办公室 实验器具灭菌、消毒及使用操作规程 ZL-03-088 GMP 办公室 进出微生物限度实验室操作规程 ZL-03-259 GMP 办公室 CHK 型显微镜操作规程 SB-03-153 GMP 办公室 厌氧罐操作规程 SB-03-156 GMP 办公室 MS1 型振荡器操作规程 SB-03-381 GMP 办公室 BL610 型电子天平操作规程 SB-03-324 GMP 办公室 SKP-02B 型电热恒温箱操作规程 SB-03-375 GMP 办公室 SKP-02B 型电热恒温箱清洁规程 SB-03-376 GMP 办公室 微生物实验室清场操作规程 ZL-03-064 GMP 办公室 破伤风杆菌检测操作规程 ZL-03-220 GMP 办公室 DELTA-320PH 计操作规程 SB-03-234 GMP 办公室 . . 致病菌阳性菌管理规程 ZL-03-112 GMP 办公室 微波炉的操作规程 SB-03-177 GMP 办公室 洁净区情场操作规程 ZL-03-112 GMP 办公室 设备清洁操作规程 SB-03-187 GMP 办公室 5.3 悬液法定量杀灭试验 5.3.1 试验所需要用的试剂 中和剂：0.1M硫代硫酸钠-生理盐水溶液（ 0.9%N.S） 活菌计数用培养基：TSA培养基 稀释液：磷酸盐缓冲液（PBS 0.03mol/L 消毒剂配制用水：纯化水 有机干扰物质 5.3.2 试验所需要用的仪器 移液器、电动混匀器、计时器、生化培养箱 5.3.3 试验所需要用的菌种 可根据消毒技术规范2008年版 4“细菌定量杀灭试验”中指导，本次试验选择金 黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉。再增加车间常见的菌： 洋葱伯克霍尔德菌。 5.3.4 试验所需要用的消毒液的浓度及作用时间 根据优洁消毒液说明书建议浓度为1%-3%，作用时间为1-2min，但根据厂家验证报告 0.1%及 0.2%的浓度作用5min和15min也能符合规定，因此本次试验浓度选择0.2%，作用时 间选择2.5min、5min以及7.5min的条件进行确认，又因车间裸手消毒作用时间可能只有 30s，故本次试验同时对0.2% 消毒剂作用15s 、30s以及45s的条件进行确认。 5.3.5 试验所需要用到的场所 微生物实验室阳性间 5.3.6 悬液定量杀菌试验操作程序 （1）菌悬液：浓度为110 8cfu/ml-5108cfu/ml （2）消毒液的配制：用纯化水按体积比配制浓度为0.2%的消毒液500ml （3）磷酸盐缓冲液的配制：磷酸盐缓冲液（PBS 0.03mol/L）称取无水磷酸氢二钠 2.83g、磷酸二氢钾1.36g加入到1000ml蒸馏水中，待完全溶解后，调 PH至7.2-7.4 ，灭菌后 使用。 （4）有机干扰物质的配制：按30g牛血清白蛋白中加入1000ml 蒸馏水的比例配制约 100ml，溶解后用0.45um的无菌滤膜进行过滤除菌后使用，未用完的可于2-8 冰箱中保存。 （5）试验过程（以浓度为0.2%优洁消毒剂对金黄色葡萄球菌作用2.5min为例） 试验组：取无菌大试管加入0.5ml金黄色葡萄球菌菌悬液，再加入 0.5ml的有机干扰物 质，分别用无菌吸管吸取0.2% 的优洁消毒液4.0ml，加入试管中，迅速混匀并立即计时。待 金黄色葡萄球菌与0.2%的优洁消毒液相互作用 2.5min时，吸取0.5ml 试验菌与消毒剂的混合 . . 液，加于4.5ml经灭菌的0.1M硫代硫酸钠- 生理盐水溶液中，混匀。金黄色葡萄球菌与消毒 剂混合液经硫代硫酸钠-生理盐水溶液作用 10min后，吸取1.0ml 样液，按活菌培养计数测定 方法测定存活菌数，每管样液接种2个平皿即可。如果菌液浓度较高时，可进行10倍系列稀 释后，在进行活菌培养计数，作为试验组，其计数结果为C X。 阳性对照组：用4.0ml磷酸盐缓冲液代替4.0ml0.2% 的优洁消毒液与 0.5ml金黄色葡萄球 菌菌悬液、0.5ml有机干扰物质混合2.5min后，取0.5ml混合液与4.5ml0.1M硫代硫酸钠-生理 盐水溶液反应，作用10min后。计数方法同试验组，计数结果为 C0。 阴性对照组：吸取此次试验用的纯化水0.5ml、0.5ml有机干扰物质、4.0ml磷酸盐缓冲 液混匀，混匀后取0.5ml混合液与4.5ml0.1M硫代硫酸钠-生理盐水溶液作用10min后，吸取 1.0ml混合液，按活菌培养计数测定方法测定存活菌数，作为阴性对照。 培养：所有用细菌试验的样品均放入30-35 培养箱中培养，培养48小时观察结果；用 真菌试验的样品放入23-28培养箱中培养，培养72小时观察结果。 5.3.7 试验要求 作用于不同试验菌不同作用时间后的消毒效果试验均须进行3次，每次进行时应注意所 用的试剂等物品均应重新配制，防止系统误差的发生。 5.3.8 活菌计数结果应换算为对数值（N ） 按计算公式杀灭对数值KL=阳性对照组平均浓度对数值（N 0）- 试验组活菌浓度对数值 （N X） 。计算杀灭对数值的时候，取小数点后两位值，可以进行数字修约。如果消毒试验 组消毒处理后平均生产菌落数小于等于1时，其杀灭对数值，即大于等于试验前对照组平均 活菌浓度的对数值。 5.3.9 判断标准 阴性对照应无菌生长；细菌各次试验的杀灭对数值均应5.00，可判断为对细菌消毒合 格；真菌各次试验的杀灭对数值为4.00，可判定该产品对真菌污染物消毒合格。 5.3.10 试验记录 附件四 悬液法定量杀灭试验记录 第一次 表5-2 第二次 表5-3 第三次 表5-4 5.3.11 试验结 作用于不同试验菌不同作用时间后的消毒效果试验进行了3次，且每次试验结果均符合 标准，所以判定0.2%优洁消毒剂通过悬液定量杀灭试验，对细菌、真菌消毒合格。 5.4 对裸手消毒效果试验 5.4.1 试验所需要用的试剂 Rodac 碟培养基平板 5.4.2 试验所需要用的仪器 计时器、生化培养箱 5.4.3 试验所需要用的消毒液 . . 浓度为0.2%的优洁消毒剂作用 0.5min 5.4.4 试验所需要用到的场所 抗肿瘤粉针车间 5.4.5 试验的操作程序 从车间抽取6名生产人员，均按照标准洗手操作规程进行洗手，将手烘干，用0.2%的 优洁消毒剂对双手进行喷洒消毒，自然晾干，于消毒后的0.5min 将一手五指尖在Rodac 平板 上按压取样，于30-35 培养箱中培养三天，观察最终结果。 5.4.6 试验的判断标准 在消毒剂作用0.5min后6份样品的菌落数均须5cfu/皿，可判为合格，本次试验应重复 进行三次，用来判断该方法是否稳定。 5.4.7 试验记录 表5-5 对裸手消毒效果试验第一次试验记录 培养时间（cfu/皿）试验人员 第一天 第二天 第三天 可接受标准 （cfu/皿） 结果判断 8001 0 2 9 5 不合格 8002 0 39 39 5 不合格 8003 0 1 3 5 合格 8004 0 40 40 5 不合格 8005 0 16 14 5 不合格 8006 0 2 4 5 合格 QA 左手 0 0 0 0 合格 QA 右手 0 0 0 0 合格 表5-6 对裸手消毒效果试验第二次试验记录 培养时间（cfu/ 皿）试验人员 第一天 第二天 第三天 可接受标准 （cfu/皿） 结果判断 8001 0 33 31 5 不合格 8002 0 8 6 5 不合格 8003 0 100 105 5 不合格 8004 0 55 51 5 不合格 8005 0 33 36 5 不合格 8006 0 4 3 5 合格 QA 左手 0 0 0 0 合格 QA 右手 0 0 0 0 合格 表5-7 对裸手消毒效果试验第三次试验记录 培养时间（ cfu/皿）试验人员 第一天 第二天 第三天 可接受标准 （cfu/皿） 结果判断 8001 0 107 105 5 不合格 8002 0 60 60 5 不合格 8003 0 4 5 5 合格 . . 8004 0 63 61 5 不合格 8005 0 36 36 5 不合格 8006 0 28 32 5 不合格 QA 左手 0 0 0 0 合格 QA 右手 0 0 0 0 合格 5.4.8 试验结论 对车间人员进行了三次（每次6名）裸手消毒试验，试验结果显示基本不符合标准，因 此判定0.2%浓度优洁消毒剂对人员裸手消毒 0.5min试验不合格。 5.5 消毒剂对佩戴手套后的消毒效果验证 5.5.1 无菌手套载体喷雾定量杀菌试验 （1）试验所需要用的试剂 中和剂：0.1M 硫代硫酸钠-生理盐水溶液（ 0.9%N.S） ； 活菌计数用培养基：TSA 培养基； 稀释液：磷酸盐缓冲液（PBS0.03mol/L ） ； 消毒剂配制用水：纯化水 （2）试验所需要用的仪器 刻度吸管、数字可调移液器、电动混匀器、计时器、培养箱、无菌手套及无菌剪刀 （3）试验所需要用的菌种 本次试验主要是验证该消毒剂对手部微生物的消毒效果，故选择金黄色葡萄球菌、大 肠埃希菌、白色念珠菌作为试验菌。 （4）试验所需要用的消毒液的浓度及作用时间 浓度为0.2%优洁消毒剂作用0.5min （5）试验所需要用到的场所 微生物实验室阳性间 （6）试验的操作步骤 菌悬液：浓度为110 8cfu/ml-5108cfu/ml 消毒液：用纯化水按体积比配制浓度为0.2%的消毒液500ml 稀释液：磷酸盐缓冲液（PBS0.03mol/L ） 试验组:取无菌剪刀从无菌手套上剪取三个手指样品，大小为10mm 10mm以三角形阵 列，均匀排布于一块未沾有任何消毒剂的无菌平皿内，逐片滴加10d的金黄色葡萄球菌，必 要时用无菌接种环涂布均匀。使制备后样品上的菌片浓度在510 5cfu/片-510 6cfu/片，用 0.2%的优洁消毒剂对制备好含有金黄色葡萄球菌的样本进行均匀喷雾，喷雾的距离约为 10cm，以尽量使喷到样本上的雾粒大小和数量一致。喷雾量以不使样本湿透、流液为度， 计时。待金黄色葡萄球菌与消毒剂相互作用至0.5min，取出样本 1片，放入一含有 5.0ml0.1M硫代硫酸钠 -生理盐水溶液的无菌试管中。将试管用电动混匀器混合20s，使菌片 上的细菌被洗脱进入0.1M硫代硫酸钠-生理盐水溶液中。吸取1.0ml上述洗液，按活菌培养 . . 计数法测定存活菌数，每管接种2个平皿。 阳性对照组：取无菌剪刀从无菌手套上剪取3个大小为10mm 10mm的手指样品，均 匀排布于一块未沾有任何消毒剂的无菌平皿内，用制备好的符合菌液浓度的金黄色葡萄球 菌滴加进去，必要时用涂布棒涂布均匀。用磷酸盐缓冲液代替0.2%的优洁消毒剂对制备好 的金黄色葡萄球菌的样本进行均匀喷雾，喷雾的距离约为10cm，以尽量使喷到样本上的雾 粒大小和数量一致。喷雾量以不使样本湿透、流液为度，计时。待金黄色葡萄球菌与磷酸 盐缓冲液相互作用至0.5min，取出样本1片，放入一含有5.0ml0.1M硫代硫酸钠-生理盐水溶 液的无菌试管中。将试管用电动混匀器混合20s，使菌片上细菌被洗脱进入0.1M硫代硫酸钠 -生理盐水溶液中。吸取1.0ml 上述洗液，按活菌培养计数法测定存活菌数，每管接种2个平 皿。 阴性对照组：取无菌剪刀从同批无菌手套上剪取三个手指样品，大小为10mm 10mm 均匀排布于一块未沾有任何消毒剂的无菌平皿内用。用纯化水代替0.2%的优洁消毒剂对手 套样本进行均匀喷雾，喷雾的距离约为10cm，以尽量使喷到样本上的雾粒大小和数量一致。 喷雾量以不使样本湿透、流液为度，计时。0.5min后取出样本一片，放入一含 5.0ml0.1M硫 代硫酸钠- 生理盐水溶液的无菌试管中。将试管用电动混匀器混合20s。吸取1.0ml上述洗液， 按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管接种2个平皿，作为阴性对照。 培养：所有细菌试验用样本均在30-35 培养箱中培养，培养至48h，观察最终结果； 真菌试验用样本在23-28 培养箱中培养，培养至72h，观察最终结果。 （7）试验要求及计算 试验重复3次，计算各组的活菌数（cfu/片） ，并换算为对数值（N） ，然后按计算公式 杀灭对数值KL=阳性对照组平均浓度的对数值（N 0）-试验组活菌浓度的对数值（N X） （8）试验的判断标准 阴性对照组应无菌生长，消毒剂作用于各菌的不同作用时间的杀灭对数值3.00，即 判定结果合格。 （9）试验的记录 表5-8 无菌手套载体喷雾定量杀菌试验第一次试验记录 验证菌种 C0(cfu/片) N0 CX(cfu/片) NX KL(N0-NX) 接受标准 结果判断 金黄色葡萄球菌 5.8105 5.76 0 0 5.76 3.00 合格 大肠埃希菌 1.1106 6.04 22 1.34 4.70 3.00 合格 白色念珠菌 5.4104 4.73 0 0 4.73 3.00 合格 表5-9 无菌手套载体喷雾定量杀菌试验第二次试验记录 验证菌种 C0 (cfu/片) N0 CX(cfu/片) NX KL(N0-NX) 接受标准 结果判断 金黄色葡萄球菌 5.8105 5.76 0 0 5.76 3.00 合格 大肠埃希菌 1.1106 6.04 11 1.04 5.00 3.00 合格 白色念珠菌 5.4104 4.73 0 0 4.73 3.00 合格 表5-10 无菌手套载体喷雾定量杀菌试验第三次试验记录 . . 验证菌种 C0(cfu/片) N0 CX(cfu/片) NX KL(N0-NX) 接受标准 结果判断 金黄色葡萄球菌 6.2104 4.79 0 0 4.79 3.00 合格 大肠埃希菌 2.0105 5.30 12 1.08 4.22 3.00 合格 白色念珠菌 2.7104 4.43 0 0 4.43 3.00 合格 （10）试验的结论 浓度为0.2%优洁消毒剂，三次对无菌手套载体喷雾定量杀菌试验均符合标准，判定手 套载体喷雾定量杀菌试验合格。 5.5.2 消毒剂对佩戴手套后人员手现场消毒试验 （1）试验所需要用的试剂 Rodac 碟培养基平板 （2）试验所需要用的仪器 计时器、生化培养箱 （3）试验所需要用的消毒液的浓度及取样时间 取5.5.1中符合规定的消毒剂浓度对人员手套消毒后0.5min 、15min 、35min分别取样 （4）试验所需要用到的场所 抗肿瘤分针车间或普通分针车间 （5）试验的操作步骤 从车间抽取12名生产人员，分别在A 级区安排6名，B级区安排6名。各自按照标准洗手 操作规程进行洗手，将手烘干。用试验浓度的优洁消毒剂对双手进行喷洒消毒，自然晾干， 分别于消毒后0.5min、15min、35min将五指手指尖在Rodac 平板上按压取样，取样后于30- 35培养箱中培养三天，观察最终结果（0.5min取样后生产人员对双手重新进行消毒，之 后应尽量模拟生产时的动作进行手部活动。15min取样后无需重新消毒） （6）试验的判断标准 在消毒剂作用不同时间后的菌落数的合格标准见下表5-11，每个时间段的6份样品必须 全部符合标准，才可判断合格，本次试验应重复进行三次，用来判断该方法是否稳定。 表5-11 菌落数的合格标准 洁净度级别 5 指手套 A 10 4cfu/ml）涂抹于不锈钢设备表面、地面、墙面及呼吸袋，选 择回收率较高的载体作为物体表面消毒效果试验室部分的试验载体。判断标准：回收菌液 浓度：10 3cfu/ml。 （1）试验所需要用的试剂 中和剂：0.1M硫代硫酸钠-生理盐水溶液（ 0.9%N.S） 活菌计数用培养基：TSA培养基 消毒剂配制用水：纯化水 （2）试验所需要用的仪器 刻度吸管、移液器、电动混匀器、计时器、培养箱、规格板（用不锈钢材料制备，中 央留一5.0cm 5.0cm的空格作为采样部位） 、无菌棉签、无菌接种环 （3）试验所需要用的菌种 本次试验主要是验证该消毒剂对物体表面微生物的消毒效果，故选择金黄色葡萄球菌、 大肠埃希菌作为试验菌 （4）试验所需要用的消毒液的浓度及作用时间 0.2%的优洁消毒液作用30s （5）试验所需要用到的场所 微生物实验室阳性间 （6）试验的操作步骤（以浓度为0.2%的消毒剂对金黄色葡萄球菌作用30s为例） 菌悬液：浓度为510 5cfu/ml-5106cfu/ml 试验组：取大小合适的无菌呼吸袋作为试验样本，将无菌规格板按压在样本上，用无 菌棉签沾以菌悬液均匀涂抹被试验表面的6区块（各区块25cm 2） 。用0.2%的消毒剂对三个 区块表面进行喷雾消毒，喷雾的距离约为10cm，以尽量使喷到样本上的雾粒大小和数量一 致，消毒后，将无菌棉签在5ml的中和剂试管中沾湿，分别对 3个消毒区块进行涂抹采样， 每区块横竖往返各8次。采样后以无菌操作方式将棉签剪入原中和剂试管中，电动混匀器上 混匀20s ，吸取1.0ml上述洗液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管接种 2个平皿，作 为试验组，必要时进行稀释。 阳性对照组：从6个区块中选取其他3个区块，用磷酸盐缓冲液代替消毒剂对三个区块 表面同法操作，之后将无菌棉签在5ml的中和剂试管中沾湿，分别对 3个区块进行涂抹采样， 每区块横竖往返各8次。采样后以无菌操作方式将棉签剪入原中和剂中，电动混匀器上混匀 20s，吸取 1.0ml上述洗液，按活菌培养计数法测定存活菌数，每管接种 2个平皿，作为阳性 对照组，必要时进行稀释。 阴性对照组：用一只棉签，分别蘸取同批纯化水，以无菌方式将棉签采样端剪入0.1M 硫代硫酸钠-生理盐水溶液中，在混匀器上震荡 20s，做适当稀释后，按活菌培养计数方法 测定存活菌数，每管接种2个平皿，作为阴性对照。 培养：所有试验样本均在30-35 培养箱中培养，培养48h观察最终结果。 （7）试验要求及计算 . . 试验须重复三次，计算各组的活菌数（cfu/片） ，并换算为对数值（N） ，然后按计算公 式杀灭对数值KL=对照组平均浓度的对数值（N 0）-试验组活菌浓度对数值（N X） （8）试验的判断标准 阴性对照组应无菌生长，阳性对照组菌数符合要求，所有样本的杀灭对数值均 3.00，即判定结果合格。 （9）试验的记录 表5-14 消毒剂对物体表面模拟现场鉴定试验第一次试验记录 验证菌种 C0(cfu/片) N0 CX(cfu/片 ) NX KL(N0-NX) 可接受标准 结果判断 金黄色葡萄球菌 8.1105 5.91 12 1.08 4.83 3.00 合格 大肠埃希菌 8.4105 5.92 0 0 5.92 3.00 合格 表5-15 消毒剂对物体表面模拟现场鉴定试验第二次试验记录 验证菌种 C0(cfu/片) N0 CX(cfu/片) NX KL(N0-NX) 可接受标准 结果判断 金黄色葡萄球菌 8.2105 5.91 1 0 5.91 3.00 合格 大肠埃希菌 7.9105 5.88 45 1.65 4.23 3.00 合格 表5-16 消毒剂对物体表面模拟现场鉴定试验第三次试验记录 验证菌种 C0(cfu/片) N0 CX (cfu/片) NX KL(N0-NX) 可接受标准 结果判断 金黄色葡萄球菌 3.2105 5.51 0 0 5.51 3.00 合格 大肠埃希菌 4.8105 5.68 33 1.52 4.16 3.00 合格 （10）试验结论 浓度为0.2%优洁消毒剂三次物体表面模拟现场鉴定试验（作用0.5min）均符合标准， 故判定合格。 5.6.2 消毒剂对物体表面消毒现场鉴定试验 （1）试验所需要用的试剂 Rodac 碟培养基平板、无菌生理盐水、TSA培养基、纯化水 （2）试验所需要用的仪器 计时器、培养箱； （3）试验所需要用的消毒液的浓度及作用时间 0.2%的优洁消毒剂作用0.5min （4）试验所需要用到的场所 抗肿瘤粉针车间 （5）试验操作的步骤（以彩钢板为例） 选择抗肿瘤粉针车间的洁净区表面的彩钢板，选择不易清洁的部位，取一块洁净区医 用无菌抹布，用试验浓度的消毒剂，对其表面进行喷洒消毒（按车间消毒规程进行） 。消毒 后，使用Rodac碟进行取样（对于消毒后的不同时间的采样，应于首次采样的部位比较接 近） 培养：所有试验样本均在30-35 培养箱中培养，培养三天观察最终结果。 . . （6）试验的判断标准 不同级别区域内的不同消毒对象，每次采样三个点，本次试验重复进行3次，结果与下 表进行对比，见表5-11。 表5-17 菌落数的合格标准 洁净级别 表面菌落数（非地面） 表面菌落数（地面） 设备表面标准 A 级 3cfu/ 皿 5cfu/皿 1cfu/皿 B 级 5 cfu/皿 5 cfu/皿 5 cfu/皿 C 级 25 cfu/皿 25 cfu/皿 25 cfu/皿 D 级 50 cfu/皿 50 cfu/皿 50 cfu/皿 （7）试验结果的记录 表5-18 消毒剂对表面消毒现场鉴定试验第一次试验记录 培养时间 采样区域及象 取样点 第一天 第二天 第三天 判断标准 结果判断 取样点 1 0 0 0 合格 取样点 2 0 0 0 合格（A）级 面 取样点 3 0 0 0 3 合格 取样点 1 0 0 2 合格 取样点 2 0 0 1 合格（A）级 地面 取样点 3 0 0 0 5 合格 取样点 1 0 0 0 合格 取样点 2 0 0 0 合格（A）级设备 取样点 3 0 0 0 1 合格 取样点 1 0 0 0 合格 取样点 2 0 0 0 合格（B）级墙面 取样点 3 0 0 0 5 合格 取样点 1 0 0 2 合格 取样点 2 0 0 1 合格（B）级地面 取样点 3 0 0 1 5 合格 取样点 1 0 0 0 合格 取样点 2 0 1 0 合格（B）级设备 取样点 3 0 0 0 5 合格 取样点 1 1 0 1 合格 取样点 2 1 1 0 合格(C)级墙面 取样点 3 0 1 1 25 合格 取样点 1 1 0 1 合格 取样点 2 0 14 14 合格(C)级地面 取样点 3 0 14 14 25 合格 取样点 1 1 0 0 合格(C)级设备 取样点 2 1 1 0 25 合格 . . 取样点 3 0 2 3 合格 取样点 1 3 3 3 合格 取样点 2 0 1 0 合格(D)级墙面 取样点 3 0 0 0 50 合格 取样点 1 0 0 0 合格 取样点 2 0 1 0 合格(D)级地面 取样点 3 0 0 0 50 合格 取样点 1 0 0 0 合格 取样点 2 1 0 0 合格(D)级清洗 取样点 3 0 0 0 50 合格 由于第二次、第三次试验结果相同，均合格，故此处略去表格。 （8）试验的结论 浓度为0.2%优洁消毒剂对物体表面消毒（作用 0.5min）现场鉴定试验共进行三次，结 果均符合规定。 5.7 消毒剂消毒效果验证结论 经过本次确认，浓度为0.2%浓度优洁消毒剂可用于车间无菌手套表面和物体表面消毒 （作用0.5min） ，0.2%优洁消毒剂作用0.5min不可用作人员裸手消毒。 6. 验证主要依据 6.1药品生产验证指南（ 2003年版） 6.2消毒技术规范（2008年版） 6.3中国药典（2010年版） 7. 验证合格标准 7.1 判断标准 在试验结束后，通过判定标准来确定是否合格，判定标准是：在悬液定量杀灭试验中， 细菌各次试验的杀灭对数值均应5.00时，可判定细菌消毒合格；真菌各次试验的杀灭对数 值均应4.00，可判定真菌污染物消毒合格；在载体定量杀灭试验中，各次试验的杀灭对数 值均3.00，可判定消毒合格。 7.2 现场考察试验合格标准 表7-1 菌落数的合格标准 洁净级别 表面菌落数（非地面） 表面菌落数（地面） 设备表面标准 A级 3cfu/皿 5cfu/皿 1cfu/皿 B级 5 cfu/皿 5 cfu/皿 5 cfu/皿 C级 25 cfu/皿 25 cfu/皿 25 cfu/皿 D级 50 cfu/皿 50 cfu/皿 50 cfu/皿 . . 8. 再验证周期 8.1当消毒剂的使用浓度和清洁消毒程序发生变更时应进行再验证。 8.2当环境中出现新类型的微生物时，应以该微生物为挑战菌进行再验证。 8.3当有新的消毒剂被使用时应进行验证。 附录 附录一 验证方案会审记录 会审日期：_年_月_日 验证方案名称 验证方案编号 姓 名 部 门 职 务 会审意见 修改内容 质量副总 同意 不同意 生产副总 同意 不同意 质保部 部门负责人 同意 不同意 质保部 质保员 同意 不同意 . . 质检部 部门主管 同意 不同意 生产二部 部门经理 同意 不同意 设备部 部门经理 同意 不同意 附录二 验证方案修改申请及批准书 验证方案名称 验证方案编号 修改内容 修改原因及依据 . . 修改后方案 起草人_部门经理_ 年 月 日 验证委员会审批 验证委员会： 年 月 日 附录三 漏项和偏差处理记录 验证方案名称 验证方案编号 漏项和偏差内容 漏项和偏差原因 . . 漏项和偏差修改后内容 验证委员会审批 附录四 悬液法定量杀灭试验记录 表5-2 悬液法定量杀灭试验第一次试验记录 验证菌种 作用时间 C0(cfu/ml) N0 Cx(cfu/ml) Nx KL(N0-Nx) 接受标准 判断标准 15s 0 0 6.43 合格 30s 0 0 6.43 合格 45s 0 0 6.43 合格 2.5min 0 0 6.43 合格 5min 0 0 6.43 合格 金黄色 葡萄球菌 7.5min 2.7106 6.43 0 0 6.43 5.00 合格 15s 0 0 6.67 合格 30s 0 0 6.67 合格 45s 0 0 6.67 合格 2.5min 0 0 6.67 合格 5min 0 0 6.67 合格 大肠 埃希菌 7.5min 4.7106 6.67 0 0 6.67 5.00 合格 15s 1 0 6.49 合格 30s 30 1.48 5.01 合格 45s 2 0.30 6.19 合格 2.5min 0 0 6.49 合格 铜绿 假单胞菌 5min 3.1 106 6.49 0 0 6.49 5.00 合格 . . 表5-3 悬液法定量杀灭试验第一次试验记录 验证菌种 作用时间 C0 (cfu/ml) N0 Cx(cfu/ml) Nx KL(N0-Nx) 接受标准 判断标准 15s 0 0 6.36 合格 30s 0 0 6.36 合格 45s 0 0 6.36 合格 2.5min 0 0 6.36 合格 5min 0 0 6.36 合格 金黄色 葡萄球菌 7.5min 2.3106 6.36 0 0 6.36 5.00 合格 15s 0 0 6.75 合格 30s 0 0 6.75 合格 45s 0 0 6.75 合格 2.5min 0 0 6.75 合格 5min 0 0 6.75 合格 大肠 埃希菌 7.5min 5.6106 6.75 0 0 6.75 5.00 合格 15s 0 0 6.72 合格 30s 0 0 6.72 合格 45s 0 0 6.72 合格 2.5min 0 0 6.72 合格 5min 0 0 6.72 合格 铜绿 假单胞菌 7.5min 5.2 106 6.72 0 0 6.72 5.00 合格 7.5min 0 0 6.49 合格 15s 0 0 6.57 合格 30s 0 0 6.57 合格 45s 0 0 6.57 合格 2.5min 0 0 6.57 合格 5min 0 0 6.57 合格 洋葱伯克 霍尔德菌 7.5min 3.7106 6.57 0 0 6.57 5.00 合格 15s 0 0 5.45 合格 30s 0 0 5.45 合格 45s 0 0 5.45 合格 2.5min 0 0 5.45 合格 5min 0 0 5.45 合格 白色 念珠菌 7.5min 2.8105 5.45 0 0 5.45 4.00 合格 15s 0 0 4.34 合格 30s 2 0.30 4.04 合格 45s 0 0 4.34 合格 2.5min 0 0 4.34 合格 5min 0 0 4.34 合格 黑曲霉 7.5min 2.2104 4.34 0 0 4.34 4.00 合格 阴性对照组 0 0 合格 . . 15s 0 0 6.15 合格 30s 0 0 6.15 合格 45s 0 0 6.15 合格 2.5min 0 0 6.15 合格 5min 0 0 6.15 合格 洋葱伯克 霍尔德菌 7.5min 1.4106 6.15 0 0 6.15 5.00 合格 15s 0 0 5.32 合格 30s 0 0 5.32 合格 45s 0 0 5.32 合格 2.5min 0 0 5.32 合格 5min 0 0 5.32 合格 白色 念珠菌 7.5min 2.1105 5.32 0 0 5.32 4.00 合格 15s 0 0 4.34 合格 30s 2 0.30 4.04 合格 45s 0 0 4.34 合格 2.5min 0 0 4.34 合格 5min 0 0 4.34 合格 黑曲霉 7.5min 2.2104 4.34 0 0 4.34 4.00 合格 阴性对照组 0 0 合格 表5-4 悬液法定量杀灭试验第一次试验记录 验证菌种 作用时间 Co(cfu/ml) No Cx(cfu/ml) Nx KL(No-Nx) 接受标准 判断标准 15s 0 0 6.36 合格 30s 0 0 6.36 合格 45s 0 0 6.36 合格 2.5min 0 0 6.36 合格 5min 0 0 6.36 合格 金黄色 葡萄球菌 7.5min 2.3106 6.36 0 0 6.36 5.00 合格 15s 0 0 6.74 合格 30s 0 0 6.74 合格 45s 0 0 6.74 合格 2.5min 0 0 6.74 合格 5min 0 0 6.74 合格 大肠 埃希菌 7.5min 5.5106 6.74 0 0 6.74 5.00 合格 15s 0 0 6.72 合格 30s 0 0 6.72 合格 45s 0 0 6.72 合格 2.5min 0 0 6.72 合格 5min 0 0 6.72 合格 铜绿 假单胞菌 7.5min 5.3 106 6.72 0 0 6.72 5.00 合格 . . 15s 0 0 6.08 合格 30s 0 0 6.08 合格 45s 0 0 6.08 合格 2.5min 0 0 6.08 合格 5min 0 0 6.08 合格 洋葱伯克 霍尔德菌 7.5min 1.2106 6.08 0 0 6.08 5.00 合格 15s 0 0 5.30 合格 30s 0 0 5.30 合格 45s 0 0 5.30 合格 2.5min 0 0 5.30 合格 5min 0 0 5.30 合格 白色 念珠菌 7.5min 2.0105 5.30 0 0 5.30 4.00 合格 15s 0 0 4.36 合格 30s 2 0.3 4.06 合格 45s 0 0 4.36 合格 2.5min 0 0 4.36 合格 5min 0 0 4.36 合格 黑曲霉 7.5min 2.3104 4.36 0 0 4.36 4.00 合格 阴性对照组 0 0 合格 附录五 消毒剂对佩戴手套后人员手现场试验记录 表5-12 消毒剂对佩戴手套后人员手现场消毒试验记录A 级区第一次 培养时间（A ）级区 试验人员 消毒后 间隔时间 第一天 第二天 第三天 可接受标准 （cfu/皿） 结果判断 0.5min 0 0 0 1 合格 15min 0 0 0 1 合格6001 35min 0 0 0 1 合格 0.5min 0 0 0 1 合格 15min 0 0 0 1 合格6002 35min 0 0 0 1 合格 0.5min 0 0 0 1 合格 15min 0 0 0 1 合格6003 35min 0 0 0 1 合格 . . 0.5min 0 0 0 1 合格 15min 0 0 0 1 合格6004 35min 0 0 0 1 合格 0.5min 0 0 0 1 合格 15min 0 0 0 1 合格6005 35min 0 0 0 1 合格 0.5min 0 0 0 1 合格 15min 0 0 0 1 合格6006 35min 0 0 0 1 合格 QA左手 35min 0 0 0 0 合格 QA右手 35min 0 0 0 0 合格 由于第二次、第三次试验的数据与第一次的相同，结果均合格，此处略去表格。 表5-13 消毒剂对佩戴手套后人员手现场消毒试验记录B 级区第一次 培养时间（B）级区 试验人员 消毒后 间隔时间 第一天 第二天 第三天 可接受标准 （cfu/皿） 结果判断 0.5min 0 0 0 5 合格 15min 0 0 0