CAR-T治疗恶性血液病至今临床数据解读

.迄今为止靶向CD19的CAR-T治疗恶性血液病临床试验结果解读摘要靶向CD19的嵌合抗原受体（CAR）T细胞在治疗B细胞恶性肿瘤患者取得令人瞩目的成果。尽管这CAR修饰的T细胞靶向相同的抗原，其CAR分子设计不同，并且临床研究的关键环节已被研究。目前还不清楚这些差异是否会对临床结果和治疗相关毒性产生影响。在此，我们根据CAR分子设计和制备的不同，回顾了靶向CD19的CAR-T细胞在治疗B细胞恶性肿瘤患者的临床研究结果，比较这些研究之间的内在局限性并进行概述。引言嵌合抗体受体修饰的自体T细胞在治疗难治性B细胞恶性肿瘤获得了较高的缓解率。CAR是由胞外单链可变区（scFv）抗体衍生物构成的重组受体，与胞内T细胞受体信号域连接，使T细胞独立于HLA对肿瘤具有特异性。幼稚T细胞的增殖与分化，需要两种特异性抗原肽的相互作用：MHC与T细胞受体结合（第1信号）以及T细胞表面共刺激受体与靶细胞或特定的抗原呈递细胞相应配体相互作用的共刺激信号。已经有数代CAR被开发并进行了临床试验研究。第一代CAR为连接在T细胞受体/CD3复合体的CD3内切域的靶向特异性scFv。第一代CAR-T细胞表现出有限的扩增性和持久性，以及有限的抗肿瘤效应，第二代CAR加入了共刺激分子（如CD28、4-1BB）以提供第二信号，第三代CAR则是串联多个共刺激域。不同机构构建的靶向CD19的CAR-T细胞在治疗儿童和成人复发B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL），慢性淋巴细胞白血病（CLL），和B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）表现出稳定高效的抗肿瘤效力。各机构产品在CAR的设计、T细胞活化与转导方法以及细胞剂量上有所不同（表1）。此外，异质患者群体CAR-T细胞注射剂量，淋巴细胞删除性化疗方案。在本综述中，我们侧重于一些CD19-CAR-T治疗恶性血液疾病成熟和初步的临床研究，注重临床结果，相关毒性和体内T细胞的持久性，并根据治疗方案的差异对观察到的结果进行分析。CD19-CAR-T在治疗B细胞恶性血液肿瘤中临床疗效CD19-CAR-T产品特点，淋巴细胞删除性化疗以及相关的临床结果总结与表1.靶向CD19 CAR-T细胞治疗成人B-ALL纪念斯隆-凯特琳癌症中心（MSKCC）和费雷德记癌症研究中心（FHCRC）公布的CD19-CAR-T治疗成人复发性B-ALL研究数据最多。MSKCC团队在美国血液学会（ASH）公布了他们利用CD28共刺激域（19-28）CAR治疗46例成人患者阶段性成果。患者高风险特点包括3次的一线治疗（n=26），接受过异基因造血干细胞移植（alloHSCT,n=18）以及费城染色体阳性（n=14）。T细胞输注前，25例患者具有形态学的疾病负荷（骨髓原始细胞5%或髓外浸润），21例患者有微小残留(骨髓原始细胞5%)，45例可评估患者中有37例达到或维持形态学完全缓解（CR），36例可评估患者中有30例经流式细胞检测微小残留为阴性（MRD-）。完全缓解率没有对年龄、疾病负荷、一线治疗次数以及异基因造血干细胞移植等因素进行分类。37例CR患者中13例曾接受异基因造血干细胞移植，但接受异基因造血干细胞移植和没有接受造血干细胞移植的患者6个月总生存期（OS）没有差异（分别为79%和80%）。6个月OS患者保持MRD-占80%。18例患者在随访期内复发，其中3例患者检测不到CD19的表达。在ASH会议上FHCRC的研究人员公布了CD19-CAR-T治疗29例成人患者I期临床试验的最新研究结果。与MSKCC的主要差异在4-1BB共刺激域（vs CD28）以及CD4+与CD8+细胞单独单独培养并按1:1的比例进行输注。这个小组近期公布的前期临床研究表明，定义了T细胞组成的CD19-CAR-T产品，最有效的经转导的T细胞亚群（即CD4+细胞分泌的细胞因子更多，尤其幼稚CD4+ CAR-T细胞可极强促进具有中央记忆表型的CD8+CAR-T细胞的抗肿瘤效应），总剂量更低单个患者间剂量更均一，并且可能产生增效作用。10例患者曾接受过异基因造血干细胞移植，CAR-T输注前骨髓原始细胞比例中位数为17%（范围：097%）。可评估的12例患者接受环磷酰胺（Cy）淋巴细胞删除性化疗有10例患者获得骨髓缓解，10例患者中7例复发（中位复发时间66天）。5例患者经CAR-T细胞再处理无应答。研究人员推测更强的淋巴细胞删除性化疗可增强T细胞的持久性，后续的患者采用氟达拉滨（Flu）25mg/m2 x3天和环磷酰胺60mg/kg的方案。所有接受Cy/Flu的患者都获得骨髓CR，并且接受Cy/Flu方案的患者无疾病生存期比接受Cy单药方案的患者长。输注后获得/维持CR的患者MRD状态尚未确定。CD19-CAR-T治疗儿童B-ALL费城儿童医院（CHOP）/宾夕法尼亚大学（UPenn）研究者对含4-1BB共刺激分子靶向CD19的CAR-T(CTL019)治疗25例儿童复发B-ALL进行详细的报道。12%患者为第一次复发，88%患者复发次数2次，72%患者曾接受过异基因造血干细胞移植。白细胞采集术后，患者接受主治医师的临时治疗。最新结果显示在CTL019输注前62%患者具有形态学疾病负荷，38%患者有微小残留。6例初次复发的患者中有3例通过流式细胞术检测不到CD19的表达，CTL019细胞持续存在。2015年ASH年会上研究人员对CTL019治疗53例儿童/青壮年复发难治B-ALL患者最新结果进行报告（表1）。41例可检测的B-ALL，12例患者MRD-。53例患者有50例获得/维持形态学CR，50例可评估患者通过流式细胞术检测有45例患者MRD-。20例输注CTL019复发的患者中，13例原始细胞CD19阴性。根据西雅图儿童医院的初步报告，使用含4-1BB共刺激域（JCAR017）有利于提高复发难治性B-ALL的完全缓解率，尽管成熟的研究数据尚未被报道（NCT02028455）。美国国立癌症研究所（NCI）的研究者进行了20例CD19-CAR-T治疗儿童复发性B-ALL的安全性和有效性进行了研究。与CHOP相反，65%患者之前没有进行异基因造血干细胞移植。20例患者中有14例获得/维持CR，14例中12例MSD-。这12例患者中有10例随后进行了异基因造血干细胞移植，除了这10个人其他都未进行造血干细胞移植。CD19-CAR-T输注后不足6个月有4例患者复发，2例在输注后获得MRD+的完全缓解，2例在输注后获得MRD-的完全缓解，但未接受异基因造血干细胞移植。研究者对复发患者再次进行CAR-T输注（第一次输注后2-2.5个月），没有出现客观应答。CD19 CAR-T治疗CLL和B-NHL尽管首次探讨CD9-CAR-T治疗CLL和B-NHL患者，并且缺乏成熟数据报告。Upenn的研究者使用CTL019治疗40例复发难治性CLL患者。他们以摘要的形式报告了II期临床剂量优化研究，26例复发难治性CLL患者在淋巴细胞删除性化疗后随机接受5x107 (n=13) vs. 5x108 (n=13) CTL019。高风险包括P53/17p染色体异常（n=10）以及依鲁替尼耐药（n=2）。23例患者中有9例获得客观应答，包括5例获得CR，在这些CR患者中MRD状态未报道，剂量与应答关系并不明显。3例患者在获得响应后疾病进展，表现出CD19阴性侵袭性淋巴瘤（n=2）或CTL019丢失（n=1）。最近，研究人员发表了一份详细的CTL019探索性治疗14例成人复发性CLL的后续报告。患者前期治疗次数中位数为5，6例患者有染色体缺失。14例患者有8例出现明显的客观反映，4例患者在CTL019输注后获得CR，获得CR的患者在3个月后进行免疫球蛋白重链深度测序分析得出MRD为阴性。所有获得PR患者在治疗后5-13个月出现复发，获得CR的患者未出现复发，中位数为40个月（范围：2153个月）。NCI的研究中使用CD19-CAR-T治疗8例患有复发性CLL和B-NHL的患者。除了淋巴细胞删除性化疗，患者在细胞输注后接受IL-2治疗直至毒性消除。响应持续了7-18个月，1例获得CR的CLL患者发生B细胞再生障碍。该小组随后使用低剂量CAR-T细胞对15例化疗难治性DLBCL和其他惰性B-NHL进行治疗，并且不使用IL-2。7例可评估的难治性DLBCL患者有4例获得CR，其中3例获得持久应答（9-22+个月），3例CLL患者通过流式细胞术对骨髓进行检测，评价为获得持久性CR（1423+个月）在2015ASH年会上，UPenn和FHCRC的研究者展示了CD19-CAR-T细胞治疗成人复发难治性B-NHL的初步成果。UPenn报告了38例成人复发难治性B-NHL患者在淋巴细胞删除性化疗后使用CTL019。24例患者接受了CTL019方案的规定使用剂量，22例可评估患者中有15例产生了客观应答，包括7/13的DLBCL和7/7的滤泡性淋巴瘤（FL），获得CR的比例尚不清楚。在FHCRC的试验中，CD4+和CD8+细胞以1:1的比例扩增与输注，这与他们在B-ALL中的研究相似。FHCRC报告中28例B-NHL患者中有16例曾接受造血干细胞移植（自体13例，异体3例）。12例基于环磷酰胺淋巴细胞删除性化疗的患者大部分CAR-T细胞持续性短，与FHCRC在成人ALL中的研究经验相似，观察到了鼠源CAR转导的毒性T淋巴细胞介导的应答反应。12例患者中有6例观察到客观应答反应（CR 1例DLBCL，PR 5例）,5例患者再次治疗未出现进一步的临床反应。同样，在随后的16例患者中淋巴细胞删除性化疗增加使用氟达拉滨，观察到客观反映率为67%，（CR 42%）,8例DLBCL有6例产生客观应答（CR 3例），3例FL有2例获得CR。额外6例复发难治性CLL患者，在输注4周后通过流式细胞术检测有5例患者外周血和骨髓的原始细胞得到完全清除。MSKCC的研究者还报道了复发难治性PET阳性和/或骨髓浸润B-NHL患者，在进行大剂量化疗和自体造血干细胞移植后接受5x106-1x107 19-28z CAR-T细胞/kg剂量的CAR-T挽救性治疗。截至2015年ASCO年会，11例入组患者有6例获得CR，其中4例仍在持续CR（1321+个月）CD19-CAR-T细胞毒性所有的CD19-CAR-T试验都报道了治疗相关性毒性反应，特别是CRS，神经毒性和B细胞发育不全，虽然观察到的毒性严重程度不相同。CRS是在CAR-T输注后数小时到数天内发生的全身炎症反应综合征，其特征为促炎性细胞因子的增高和T细胞的活化与扩增，临床症状包括发烧，肌痛，乏力，在严重情况下，出现与毛细血管渗漏综合征相关的缺氧，低血压，偶发的肾功能不全以及凝血功能障碍。试验使用不同定义对CRS进行分级，而当前的不良事件通用术语标准（CTCAE）CRS分级只对输液相关症状进行描述。严重的CRS可使用IL-6受体拮抗剂妥珠单抗进行抗细胞因子治疗，或者使用糖皮质激素治疗。所报告的种类，发生率，严重程度和CRS治疗，神经毒性都总结在表2中。B细胞再生障碍是CD19-CAR-T的毒性和有效性标志物，尤其在CAR-T持久存的患者身上可以观察到。部分B细胞再生障碍在静脉注射免疫球蛋白（IVIG）后可能会消失。CD19-CAR-T治疗儿童B-ALL的毒性根据CHOP和UPenn研究者公布研究报告，他们观察到接受治疗的全部25例儿童患者都发生了CRS。根据其最近更新的数据显示，53例患者中除了5例患者，其余患者都发生了1级的CRS（表3）。严重CRS（需要给予升压药）与C-反应蛋白（CRP），铁蛋白，IL-6，IFN-及可溶性IL-2受体升高相关。输注CTL019后严重CRS比轻/中度CRS发生得早（中位数1 vs 4天）。高疾病负荷和高水平的CD3+CD8+ CTL019 细胞与CRS的严重程度密切相关。同样，NCI报道20例受试患者有15例发生CRS。CRS评价发生在输注后的4天（范围：1-7天），并且平均持续4.8天。他们都用自己的分级系统来定义CRS（表3）。最初给药剂量为3x106 CAR-T细胞/kg，4例患者有2例发生3-4级CRS，随后确定最大耐受剂量为1x106 CAR-T细胞/kg。在较低剂量下（1x106 CAR T细胞/kg）16例患者有4例（25%）发生3-4级CRS，所有患者都具有高疾病负荷。少部分患者使用了高剂量T细胞使我们推断T细胞剂量与严重CRS的关联受到局限。MSKCC和CHOP的研究与之类似，高疾病负荷和严重的CRS相关联。所有CRS都是完全可逆的（总结于表2）。研究人员对17例患者在治疗的1个月内进行了脑脊液(CSF)的取样，检查脑脊液中CAR-T细胞的存在，并报告了CSF中CAR-T与神经毒性的关系。因样本量较小，仅有6例出现神经毒性的患者在CSF中检测到CAR-T。此外，在MSKCC对成人B-ALL的研究中并未发现神经毒性与CSF中是否存在CAR-T的相关联。CD19-CAR-T治疗成人B-ALL的毒性46例复发性B-ALL患者接受MSKCC 19-28 CAR T细胞治疗，有11例发生严重CRS（即需要升压药或机械通气）。发生严重CRS的患者在CAR-T细胞输注时都有形态学疾病负荷。此外，研究显示T细胞剂量与严重CRS相关联。11例有形态学病灶的患者接受3x106 19-28 CAR T细胞/kg，有3人发生与治疗相关的5级毒性（败血症、多功能器官衰竭）。随后对细胞剂量进行了调整，具有形态学疾病负荷的患者接受剂量为1x106 19-28 CAR T细胞/kg。而疾病负荷很低的患者接受剂量为3x106 19-28 CAR T细胞/kg。14例具有形态学病灶的患者与21例疾病负荷较低的患者都没有发生5级治疗相关毒性。患者在CAR-T细胞输注后出现神经毒性类似于对儿童治疗的报道。虽然严重CRS仅发生在高疾病负荷的患者，但21例仅有微小病灶的患者有3例（14%）发生3-4级的神经毒性。NCI的研究人员同样在治疗成人B-ALL中观察到疾病负荷和严重CRS的相关性。在2014ASH年会上，UPenn的研究者公布了CART019治疗复发性B-ALL I期临床试验的初步结果。12例患者有11例出现了严重的CRS。11例严重CRS患者中有8例经IL-6拮抗剂治疗后获得缓解，但3例患者对妥珠单抗和糖皮质激素耐受，在CART019输注后3-15天内死亡。这3例患者都具有较高的疾病负荷，在接受环磷酰胺300mg/m2 q12h x6后输注剂量为6.58.45x106 CTL019细胞/kg的CAR-T细胞。这3例患者相对于另外9例患者接受了更高剂量（平均高3.62x106细胞/kg）的CAR-T细胞，这表明高剂量的细胞与毒性的增加可能相关联，这也在MSKCC和NCI的研究中也被观察到。CD19-CAR-T治疗成人CLL和B-NHL的毒性UPenn的研究者在使用CTL019治疗CLL的患者中观察到迟发性CRS，一些患者在CTL019输注后55天才需要接受抗细胞因子治疗。CRS与T细胞扩增峰值相关，但是与B-ALL不同，治疗前高疾病负荷不能对CRS进行预测。尽管使用像治疗成人B-ALL那样高剂量的T细胞治疗CLL患者，但没有出现5级CRS。然而有1例B-NHL患者发生5级脑炎可能与CTL019治疗相关。FHCRC报告称在B-NHL患者中使用Cy淋巴细胞删除性化疗后输注2x105-2x107 CAR-T细胞/kg没有出现剂量相关性毒性（DLT）,尽管在7例患者在Cy和Flu预处理接受2x107 CAR-T细胞/kg输注后，有2例患者在输注后第一天IL-6升高预示会发生严重毒性反应。NCI研究小组发现，15例BLBCL或惰性B细胞血液恶性肿瘤的患者有13例出现3级毒性，主要出现在CAR-T细胞输注2周内。IL6和/或IFN-升高同时毒性反应最重。在MSKCC的研究中，复发难治性侵袭性B-NHL患者在高剂量化疗和自体干细胞治疗后输注19-28CAR T细胞，DLT引发的CRS细胞剂量水平为1x107 19-28/kg。11例患者有6例发生严重CRS，使用妥珠单抗和糖皮质激素都获得了有效的治疗。总之，治疗前高疾病负荷与严重CRS风险的增加相关，而用高剂量CAR-T治疗CLL和B-NHL患者没有出现这一的相关性。而类似CD19-CAR引发神经毒性的相关机制尚不清楚。CSF中存在CAR-T被认为是一个潜在因素，但在CSF中检测到CAR-T却不一定出现神经毒性症状，这表明它们不太可能介导神经毒性。CAR-T在体内的扩增与持久性CAR-T在体内的持久性通常被认为CAR-T治疗发挥长期临床疗效的标志。在某种程度上，缺乏标准的检测方法来衡量CAR-T在血液或骨髓中持续时间数据。最广泛的CAR-T持续性数据来自CHOP、UPenn和NCI的研究，他们都使用流失细胞术和定量聚合酶联反应（qPCR）来检测CAR-T在体内的扩增和持久性。表面表达CAR分子的CAR-T细胞可以用流式细胞术检测，而细胞表面没有表达CAR的转导T细胞需要qPCR检测。CHOP在儿童B-ALL患者的研究中，研究者利用qPCR对CTL019进行长达2年的检测，DNA定量拷贝数下限为5 copies/g。有趣的是，有3例对CTL019没有任何应答的患者qPCR检测到很高的峰值（6,066-178,481copies/g DNA），而流式细胞术却没有检测到循环CTL019的存在。UPenn的研究者使用qPCR检测接受治疗的成人CLL患者体内CAR-T的持久性，指定检测下限为25 copies/g DNA。他们报道指出扩增与持久性的程度与应答相关，有4例获得MRD-的完全缓解的患者CTL019持续了14-49个月，其中一些患者B细胞再生障碍持续了4年。同样，在治疗CLL患者的剂量优化试验中，研究者发现在所有出现应答的患者体内CTL019都出现扩增，通过流式细胞术检测在在扩增高峰CTL019在CD3+细胞中所占比例较高。NCI用qPCR分析儿童B-ALL患者的下限量为100 copies/g DNA。通过qPCR或流式细胞术检测，在输注后第14天CAR-T在体内扩增达峰值，在输注后68天后所有患者都检测不到扩增，并且伴随着正常B细胞再生。然而，在此项研究中CAR-T持久性分析是有限的，因为大多数患者在获得MRD-的完全缓解后平均51天（范围45-82天）进行了异基因造血干细胞移植。有4例患者在检测到CAR-T就立即准备进行异基因造血干细胞移植，异基因造血干细胞移植后就不在进行CAR-T细胞检测。NCI研究者报道在B-NHL患者中外周血CAR-T持久性达181天。峰值出现在输注后的前10天并且变化范围很大。根据他们的最新报告，在7-17天检测到CAR-T细胞扩增的最高峰(9777 CAR+ 细胞/L)，之后就会迅速下降。没有指明扩增峰值和应答明确的相关性，也没有指明最长持久性。目前还不清楚加入4-1BB共刺激域是否可以延长CAR-T的持续时间（如：可能改善T细胞耗竭），或因为免疫清除的一些因素限制了CAR-T的持久性（如NCI和FHCRC报道的CTL介导的抗CAR应答）和/或淋巴细胞删除不充分。此外，一些患者检测不到循环CAR-T仍保持分子缓解，CAR-T最佳持续时间仍然未知。事实上，诱导持续缓解应答和效力深度比持续时间更加关键，因为有些患者尽管CAR-T细胞存在，但仍然会CD19阴性疾病复发。CD19-CAR-T细胞治疗的应用：认识与分歧转导方法的替代本文所描述的研究是利用逆转录病毒或慢病毒进行基因转导。这些病毒转导方法转染效率高，能可靠地生产出所需求剂量的T细胞制品。与之相比，MD安德森癌症中心（MDACC）已经研究使用非病毒睡美人（SB）系统进行基因转导。这一系统的潜在局限性包括转到效率降低，生产所需的细胞制品需要更长的时间。有点包括无需病毒转导成本避免病毒致癌风险。MDACC报道了13例B细胞恶性肿瘤患者（ALL8例，B-NHL3例，CLL 2例）其中有些患者接受过异基因造血干细胞移植，进行了剂量为1x1065x107 CAR T-细胞/m2的CAR-T治疗，3例患者健在，平均在输注后3个月缓解。另外12例患者（ALL10例，B-NHL2例）在接受了异基因造血干细胞治疗后接受了1x1065x107细胞/m2的供者来源 CAR-T，患者全部健在，并且在输注后处于缓解期平均5个月。这些早期数据表明使用SB系统制造较低活性CAR-T细胞的可能性，其他变化因素包括CAR的共刺激域，淋巴细胞删除方案。更健全和成熟的数据回顾有助于阐明基因转导的效率，CAR-T终制品的表型，扩增，持久性和临床疗效的相关策略。第一代vs.第二代CAR研究显示共刺激信号在临床前模型中的重要性。几项小规模早期临床研究中第一代CAR-T被证明临床疗效和持续性有限。此外，贝勒医学院（BCM）研究者同时使用第一代CAR-T和第二代CAR-T治疗6例复发难治性B-NHL患者。通过qPCR检测发现，加入CD28共刺激域的CAR-T细胞具有良好的增殖和持久性，输注后的2周内二代CAR分子的T细胞扩增超过6倍，输注后4-6周扩增降到最低点，并且在体外TCR再刺激可再次迅速扩增，显示了CAR-T共刺激的重要性。临床收益不大，2例患者获得3-10个月的疾病稳定，所有患者最终疾病进展。4-1BB vs. CD28共刺激域：持续性和复发广泛应用于临床的第二代CD19-CAR-T共刺激域为CD28或4-1BB（表1）。通过几项研究，4-1BB共刺激域的CAR-T持久性似乎更久。迄今为止，4-1BB共刺激域（相对于CD28）的CD19-CAR-T治疗儿童B-ALL获得MRD-的完全缓解率似乎更高（表1）。尽管有这种趋势，但无论是结合了4-1BB还是CD28共刺激域的CAR-T细胞与这些患者长期的OS和EFS的相关性仍不清楚。获得CR（接受MSKCC的19-28 CAR T治疗的37例成人患者中有18例CR，接受CHOP/UPenn的CTL019治疗的50例儿童患者中有20例CR）后复发率可能相近，尽管成人患者与儿童患者之间的差异可能使对比更加复杂化。CTL019治疗后的B-ALL患者复发会出现B系再生障碍的消失，这一情况的复发多为CD19+或CD19-的逃逸变异。相比之下，CD19-复发在19-28 CAR-T治疗后通常少一些。MSKCC和FHCRC的CD19-CAR-T治疗的成人B-ALL复发率类似，FHCRC组治疗的患者获得MRD-完全缓解率仍不清楚，而FHCRC治疗成人患者复发率高，这可能反应患者接受Cy淋巴细胞删除预处理不充分，患者体内对鼠源的scFv产生免疫应答，早期数据表明Flu可能会克服这一限制。截至目前，患有CLL和B-NHL的混合组对基于共刺激域的比较造成了干扰。在NCI，UPenn和FHCRC小组中，惰性侵袭性B-NHL患者在接受CD19-CAR-T治疗后观察到令人印象深刻的应答反应，并且哪个共刺激域的具有优势并不明显。淋巴细胞删除淋巴细胞删除性化疗可通过消除调节性T细胞提高CAR-T细胞应答，清除其他免疫细胞来争夺细胞因子的稳态，并促进抗原呈递细胞的活化。第一代CAR-T细胞可能是淋巴细胞缺失以及共刺激信号缺乏，以致抗肿瘤临床疗效受限，此外，MSKCC的早期研究中，对嘌呤类似物耐药的CLL和巨大淋巴病变的患者进行19-28CAR-T治疗，3例患者在没有进行淋巴细胞删除性化疗预处理的情况下接受1.2-3.0x107 19-28CAR T-细胞/kg治疗，结果没有出现客观应答。随后4例患者进行1.5-3.0 g/m2的Cy预处理后接受0.4-1.0x107CAR T细胞/kg,1例患者外周淋巴结显著减小，其他2例患者疾病稳定。BCM的研究者从靶向CD19特异性T细胞I期临床试验中推测出不充分的淋巴细胞删除性化疗可能会限制CAR-T的持久性。简单地说，他们对8例B细胞恶性肿瘤患者在异基因造血干细胞移植后进行供体来源的表达靶向CD19 CAR的病毒特异性T细胞（EMV,EBV,腺病毒）。没有进行淋巴细胞删除性化疗预处理。在输注后的6周内未发现IL-6，TNF-或IFN-水平的增高，在CAR-T细胞扩增的观察中，6例可评估患者有2例在输注后6周内出现明显的客观应答。在输注后的1-12周通过qPCR检测到的基因转导信号水平低下，流式细胞术未检测到CAR，2例EBV复发的患者扩增更明显。如前文所述，FHCRC的研究者在成人B-ALL和B-NHL研究中发现，充分的淋巴细胞删除性化疗预处理可防止转导基因的免疫排斥。在CAR-T细胞输注后28天，Flu与Cy预处理的患者比单独使用Cy预处理的患者具有更高的CAR-T表达水平（55.8 vs 0.1CD8+CAR-T细胞/ml，2.1 vs 0.02CD4+ CAR-T细胞/ml）。对Flu+Cy预处理组也进行了提高无疾病生存率的观察。在对成人B-NHL的观察中使用Flu+Cy的患者比单独使用Cy的患者CAR-T峰值水平更高。（31.9 vs 0.55CD8+CAR-T细胞/ml，16.5 vs 0.31CD4+ CAR-T细胞/ml）。NCI研究者最新报道了20例接受同种异体造血干细胞治疗的B细胞恶性肿瘤患者（B-NHL10人，B-ALL5人，CLL5人）接受CD28共刺激域同种异体CD19-CAR-T剂量递增(0.4-8.2x106/kg)治疗情况。尽管没有进行淋巴细胞删除性化疗，有8例患者出现明显的客观应答。值得注意的是，5例B-ALL患者有4例获得具有正常B细胞克隆的MRD-的完全缓解。在CR和PR患者中通过qPCR可检测到CAR的高表达。非ALL和DLBCL患者入组前需接受至少1次供者淋巴细胞输注（DLI），出现1级的急性移植物抗宿主（GVHD）或中级慢性GVHD有入组资格，所有患者没有出现新的GVHD。没有进行淋巴细胞删除预处理的复发性B-ALL患者在输注CAR-T后获得的客观反映仍然引人注目。观察到的活性反应得益于天然的同种异体应答反应，应答者没有发生GVHD并且B-ALL患者对DLI出现应答率低说明抗白血病活性主要为靶向同种异体抗原的免疫应答。在此试验方案中淋巴细胞删除预处理能否进一步增强同种异体CAR-T的活性尚不清楚。CAR-T剂量如表1所述，大部分输注CAR-T的剂量范围宽泛，有时使用剂量递增方案。一些报道中提出CAR-T输注剂量和CRS发生率和严重性具有相关性，多项CRS的DLT研究正在进行。如前所述，由于细胞剂量与CRS的关联，我们制定高疾病负荷的使用低剂量细胞而MRD患者使用高剂量细胞（1x106 vs. 3x106 19-28z CAR-T细胞/kg），MRD患者对高剂量CAR-T细胞耐受良好。在之前我们观察到MRD相对于高疾病负荷B-ALL患者体内CAR-T扩增较弱，说明这些患者在固定剂量的CAR-T细胞下接受的有效剂量相对较低。然而，MRD患者接受高剂量会产生更大功效尚不明确。在对儿童B-ALL，成人B-ALL，CLL和B-NHL研究中，对剂量递增计划和随机剂量的答进行比较，没有发现高剂量与高功效和持久性具有显著的相关性。目前在这些报道中样本量尚小，有效的CAR-T剂量和组份以及疗效与毒性间的平衡关系仍不明确。讨论复发难治B细胞恶性肿瘤的CD19-CAR-T治疗是一个非常有效的治疗方法。尽管在共刺激域，T细胞转导方法和输注CAR-T细胞的剂量上存在差异，但这些差异没有对应答率和持久性产生重大影响。所有这些研究都关注于疗效的常见关键因素：肿瘤的特异性和通用靶标，淋巴细胞删除性化疗，第二代CAR，短期培养的T细胞扩增。然而，因缺乏随机试验，给不同CAR结构间的客观比较带来难度。在此期间，从目前的研究中我们取得了一些经验。首先，取代传统化疗和小分子抑制剂中“剂量统一”的方案，最佳疗效和安全剂量取决于CAR-T治疗前疾病负荷（至少在B-ALL中），淋巴细胞删除性化疗和疾病类型（ALL vs. CLL/NHL）。接下来进行的临床试验确定剂量递增方案时应考虑这些因素。其次，所有靶向CD19的CAR会出现一定程度的CRS和神经毒性。不过，在我们可以比较各种治疗的毒性作用前，当务之急是建立CAR-T治疗相关的CRS和神经毒性的统一定义标准。第三，仍然没有CAR-T细胞扩增和持久性的标准检测方法。虽然qPCR更为灵敏，但它的结果与似乎更具有特异性的流式细胞术检测结果不总是相匹配。因此，今后的试验应优化可衡量CAR-T临床相关持久性的最佳检测方法。Is one CAR best?由于本综述着重凸显试验设计的差异，在此无法回答这个问题。下面再开展的临床试验可能在相同类型的患者中比较不同的CAR筛选出最优者。此外，除CD19外靶向其他靶点的CAR正进行临床评估，优化CAR-T细胞技术，提高T细胞的持久性并突破肿瘤微环境，是CAR-T治疗其他肿瘤取得显著成效的关键。表1：临床试验中CD19-CAR结构概要单链可变区是CAR的抗原识别部分。 表示38人入选，24人接受了方案剂量治疗并列入分析。Cy=环磷酰胺，Flu=氟达拉滨，ORR=客观缓解率（可评估患者），CR=完全缓解，PR=部分缓解，MRD-=微小残留病灶阴性，DLBCL=弥漫性大B细胞淋巴瘤，FL=滤泡性淋巴瘤，MCL=套细胞淋巴瘤，FS=无复发生存率，LFS=白血病无病生存，PFS=无进展生存期，OS =总体生存期。表2：截至目前CD19-CAR-T临床试验治疗相关性细胞因子风暴和神经毒性 =根据不良事件通用术语标准4.0分级。CRS=细胞因子释放综合征; NG=没有正式分级; TOCI=托珠单抗; CS =糖皮质激素表3：细胞因子风暴分级系统.