基因工程试题与答案.pdf

1、转基因动物的安全性问题 正面观点： （ 1）转基因工程是不可阻挡的 .基因工程将影响当代重大的环境问题 :人口过剩 /污染 /生 物多样性急剧减退等等 .保护土壤 /水 /能源成为发展可持续农业的目标。 （ 2)转基因食品的功效 : 改良植物的食用品质；增加果蔬贮藏、保鲜性能；生产特殊食 品 食品疫苗。 （ 3）迄今为止并没有发现转基因食品危害人体健康和环境的确切证据。如果转基因生 物技术得不到社会支持，这一研究将被扼杀。 反面观点： 转基因的潜在危害： 转基因动植物安全性评价主要集中在环境安全性，食品安全性以及对人 动物健康的影响三方面。 环境安全性 分析包括： （ 1）生存竞争性：转基因植物在生存竞争方面具有的优势可能导致生物多样性的减少， 影响了生物多样性； （ 2）生殖隔离距离 :基因不可控制的水平转移的可能性；与近缘野生种的可交配性：外 源基因是否会漂流扩散至亲缘野生种中，从而破坏自然生态平衡； （ 3）对非靶生物的影响：转基因植物花粉通过风，雨，鸟，昆虫，真菌，细菌以至整 个生物链传播使外源基因逃逸，从而造成基因污染。 （ 4）病毒发生异缘重组或异缘包装的可能性：自 然界中存在着植物病毒之间的异缘重 组。 （ 5） 对农业和生态环境的影响 ， 生态平衡 . 如产生超级杂草的可能性；种植抗虫转基 因作物后可能使害虫产生免疫并遗传、从而产生更加难以消灭的 “ 超级害虫 ” ； 食品安全性 ： （ 1）转基因毒性 .如英国发现转基因马铃薯会减弱老鼠免疫系统功能，美国发现转基因 玉米会危害蝴蝶幼虫及其相关生态环境； （ 2）人的毒理反应或过敏反应 . 大肠杆菌细胞膜间隙中含有大量的内毒素，痕量的内 毒素即可导致人体热原反应。 （ 3）实质等同性的原则，即某一种生物技术产品或其成分能够与市场上现有的对应产 品进行比较。如果一种转基因产品能够与现存的一种产品进行比较，并且发现具有实质同等 性，便能用现产品安全性同种方法对待它。转基因植物所引入的蛋白对人体可能是异性蛋白 质，在部分人中可能发生食物过敏，特别是幼儿和某些过敏体质的人。 对人动物健康的影响 ：转入传统食品或作物中的基因可能来自各种物种，有些是人们不 能或者极少食用的，是否会对人体造成危害；转基因植物食品中的新基因会不会传递给人畜 的肠道微生物，插入表达，然后危害健康。 动物： 1.外源基因在 动物基因组中的随机整合，可能会引起宿主细胞基因的插入突变、 缺失突变及宿主基因的扩增重排和移位，也可能激活正常状态下处于关闭状态的基因，从而 导致动物表型的改变甚至造成动物不育或死亡； 2.插入的外源基因是否会影响宿主动物自身的基因表达及表达水平； 3.转基因动物是否可能会把外源基因传递给生活在其周围的其它种群及环境，造成基因 污染； 4.在病毒等致病基因的转基因研究中，不可避免地会产生一些有害的转基因动物，是否 可能因为使用转基因动物制品而将一些动物性疾病传递给人类。 5.未知的 . 总的来说： 就目前而言，还没有发现转基因食品对人类有害，但同时也缺乏证据证明它的无 害性，因此产生了一些争论。 2、植物转基因方法的原理和比较 外源基因导入植物细胞的方法可分为 DNA 直接转化（ naked DNA transfer）和以载体为媒介 的基因转化（ vector mediated gene transfer）。 A. DNA 直接转移法 DNA 的直接转移是通过物理化学法将外源基因转入受体植物细胞的技术。 1. 化学刺激法 它的主要原理是植物细胞的原生质体经过某些化学药品（ PEG、 PNA、磷酸钙、氯化钙） 处理后，能够捕获外源 DNA。 2. 电击法 电击法是一种直接转移外源基因进入受体植物细胞的方法，这种方法可适用于单子叶 植物及双子叶植物细胞原生质体的转化。 3. 显微注射法 微针注射是一种经典的物理转基因技术，它是借助显微注射仪，将外源 DNA 或 mRNA 通 过机械方法直接注射到受体细胞。 4. 脂质体介导法 当脂质体与植物原生质共温育时，脂质体与原生质体膜结构之间发生相互作用，脂质体 内的外源 DNA 通过融合或吞噬作用高效率地转运到原生质体细胞质和细胞核内。 6. 微激光 束法 这种方法的原理是利用激光微束脉冲引起细胞膜可逆性穿孔，从而将外源 DNA 导入受 体细胞。 7. 花粉通道法（ Pollen-tube pathway） 该法是将外源 DNA 片段在自花授粉后的特定时期注入柱头或花柱，外源 DNA 沿花粉管 通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化不具备正常细胞壁的受精卵、合子及早期的胚体细 胞。 B. 载体介导法 所谓以载体为媒介的基因转化即是通过农杆菌或植物病毒介导感染受体植物将外源基因 转入植物细胞的技术。目前，载体法主要包括土壤农杆菌 Ti 质粒、 Ri 质粒及植物 DNA 病毒 等介导的遗传转化法。 农杆菌介导法 土壤农杆菌介导的基因转移是目前最常用的获得转基因植物的方法，它主要用于双子叶植 物系统。利用土壤农杆菌介导的基因转移的再生效率很高，且外源基因在转入并整合到植物 基因组中后未发生任何重大的修饰改变。一般来说，使用土壤农杆菌介导的基因转移方法所 转入的外源基因一般拷贝数较低，大多是单拷贝转移。 （一）农杆菌介导法： 一种载体介导法，是通过农杆菌介导感染受体植物将外源基因转 入植物细胞的技术。 农 杆菌介导法的 优点 : 1. 转化效率高 2. 能够插入非重排的外缘 DNA 长片断 3. 外缘转化 DNA 主要以单拷贝或是低拷贝形式插入 4. 不需要特殊的专用设备 缺点 : 1. 转化的寄主范围有限 ,特别是对许多单子叶植物不适用，主要适用于双子叶系统 2. 外源的转基因只能以 T-DNA 插入的方式被导入寄主细胞 （二）基因枪法： 也称微粒轰击法，是一种快速有效的植物 DNA 转移系统之一。其基 本原理是利用带有外源 DNA 的金粉或钨粉微粒经过放电或机械加速后对细胞射击。 生物弹击法的 优点 : 1. 基因转移不受物种界限的约束 2. 可适用于不同的转化样品 ,如根 ,镜 ,叶培养细胞愈伤组织 ,甚至种子等 3. 很有可能 用于培育转基因的禾谷类作物 缺点 : 1. 需要复杂的专用设备 2. 外源转化 DNA 重排频率高 ,并经常以多拷贝形式插入 3、 包装细胞 （逆转录病毒法） ：编码病毒外壳蛋白的序列整合到包装细胞染色体中， 能稳定表达产生病毒外壳蛋白 逆转录病毒法是将外源目的基因和逆转录病毒载体重组，再使之包装成为高滴度病毒颗 粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞 共孵育以达到感染的目的。携带外源基因的反转录病毒 DNA 依靠逆转录病毒的整合酶及其 末端特异性核苷酸序列可以整合到宿主染色体上，经过杂交筛选即可获得含有目的基因的动 物。 优点： 操作简便、可大量感染细胞、形成单拷贝和高转化率（可达 100） 缺点： 病毒载体可能从整合位点上脱落，恢复病毒特性，对宿主细胞的功能造成影响， 甚至使动物死亡。 4、 酵母、大肠杆菌表达外源真核基因 的过程的比较 大肠杆菌表达系统优缺点 优越性 : (1) 结构简单，生理生化和遗传背景知识，尤其是其基因表达调控机制有了 清楚的了解； (2)易于大规模培养，成本低廉；（ 3）经过了遗传改造，已发展为一种安全的 基因工程实验系统，拥有各种不同的菌株和载体系列。 不足之处（表达真核基因的障碍） :（ 1) 真核基因具有内含子，所以只能用其 cDNA； （ 2）许多真核生物基因仅在大肠杆菌中合成无特异性空间结构的多肽链；（ 3）许多真核基 因的蛋白质产物，都要经受翻译后的加工修饰，而大肠杆菌缺乏蛋白质加工系统；（ 4）大肠 杆菌内源性蛋白酶易降解外来的真 核生物基因所表达的蛋白质分子；（ 5）大肠杆菌细胞膜间 隙中含有大量的内毒素，痕量的内毒素即可导致人体热原反应。 酿酒酵母表达系统表达外源基因 优点： 1.安全性高 2.繁殖速度快 3.能高密度发酵 4.可以进行蛋白翻译后的修饰和加工等。 局限性：缺乏强有力的启动子，分泌效率差，表达菌株不够稳定，表达质粒易于丢失等。 毕赤酵母的重组特点 : 表达载体均不含酵母复制原点。导入酵母体内的重组表达载体只有和酵母染色体上的同 源区发生重组，从而整合到染色体上，目的基因才能够稳定存在并表达，这种整合的转化子 一旦形成就非常稳定。 5、质粒载体 vs 噬菌体载体： 单纯以噬菌体为基础构建的载体 :装载量大 ,能获得单链 DNA,转染效率高 ;操作较 难 ,DNA 不稳定 单纯以质粒为基础构建的载体 :有天然的抗性选择标记 ,操作容易 (宜于分离和纯化 ),较稳 定 ;装载量小 ,转化效率较低 (一 )优缺点比较 载体 优点 缺点 质粒载体 1.分子量非常小 2.具有较高的拷贝数 3.易分离 4.易改造 1.不稳定：分离不稳定，结构不 稳定，易丢失 噬菌体载体 1.具有质粒性质，便于外源 DNA 的克隆及重组 子的筛选 2.有利于提高装载量 3.较稳定，重组至宿主基因组 4.转化效率高 噬菌体可能会变化而恢复毒性对 转基因动物有害等； 宿主范围窄 (二 )异同点比较 相同点： 1、复制子：一段具有特殊结构的 DNA 序列，载体有多个复制起点才能使与它结合的 外源基因在宿主细胞中独立复制繁殖。 2、选择性标记：一般情况下，所要扩增的基因不便于选择，所以作为载体要求具有选 择标记。易于识别和筛选，如抗药性、显色表型反应等； 3、限制性酶切位点：具有一个或者几个限制性内切核酸酶的单一识别位点，便于外源 基因的插入； 4、载体的大小适当，可以插入一段较大的外源 DNA,又不影响本身的复制； 5、均有适当的拷贝数，既有利于载体的制备，还要使外源基因大量表达； 6、载体的安全性：要求载体不能随便转移 不同点： 1、质粒载体多为双链共价闭合的环状 DNA 分子，而噬菌体的核酸一般为双链线性 DNA 分子，也有双链环形 DNA、单链线性 DNA、单链环形 DNA 及单链 REN 等多种形式。 2、质粒多能独立于染色体之外自主复制，而噬菌体的 DNA 整合到寄主细胞染色体 DNA 上，成为一个组成部分。 3、质粒常含有一些编码对细菌生存有利的基因，包含抗生素抗性基因等，而噬菌体基 因一般不具有抗性基因。 4、噬菌体载体的结构要比质粒复杂，噬菌体作为基因克隆载体在克隆实验时具有天然 的优势，他们感染细胞比质粒转化细胞更为有效，所以噬菌体的克隆产量通常要高一些。 6、 DNA 酶、 RNA 酶举例说明应用、原理 限制性核酸内切酶 (Restriction Endonuclease, RE) 在研究寄主细胞对噬菌体的限制 -修饰系统中发现，它能在 DNA 特异位点上催化双 链 DNA 分子的断裂，产生相应的限制性片段。 基本特征 识别序列为 4、 5 或 6 个碱基对且具有 180旋转对称的回文结构 4bp Hpa C CGG Hae GG CC 5bp Ava G GWCC EcoR CCWGG 6bp BamH G GATTC Sma CCC GGG 11bp Bg1 GCCNNNN NGGC 12bp BstX CCANNNNN NTGC 同位酶：识别相同的序列但切点不同。如 XmaI/SmaI 同尾酶：识别位点不同但切出的 DNA 片段具有相同的末端序列。 如 MboI/BglII/BamHI,它们切割 DNA 之后都形成由 GATC 4 个核苷酸组成的粘性末端 BamHI G GATCC BglII A GATCT MboI N GATCN 同裂酶：识别位点和切割位点均相同的酶。如 HpaI/HincII 一般来说，识别序列的碱基对越多，则这种酶在 DNA 上出现的频率越低；不同生 物碱基含量不同，酶识别位点的分布及频率也不同。 切开的 DNA 末端有平头末端和粘性末端（双链 DNA 的一条链突出，如 5或 3 突出末端，在适当的温度下，两个互补粘性末端能退火形成双链分子。 限制性核酸内切酶切割双链 DNA，水解磷酸二酯键中 3位酯键产生两个末端，末端 结构是 5-P 和 3-OH，产生 3 种不同的切口。 DNA 连接酶 DNA 连接酶广泛存在于各种生物体内，其催化的基本反应形式是将 DNA 双链上相 邻的 3羟基和 5磷酸基团共价结合形成 3 -5磷酸二酯键，使原来断开的 DNA 缺口重 新连接起来，因此它在 DNA 复制，修复以及体内体外重组过程中起着重要作用。 大肠杆菌连接酶是利用 NAD+作为能源的，而 T4 噬菌体 DNA 连接酶则是以 ATP 作 为辅助因子。 碱性磷酸酶 细菌的碱性磷酸酶（ BAP）和牛小肠的碱性磷酸酶（ CIP）均能催化 DNA， RNA， 核苷酸的 5端除磷反应，因此在 DNA 重组实验中，该酶用于载体 DNA 的 5末端除磷操 作以防止载体自身连接，提高重组效率；用于末端标记。 S1 核酸酶 (S1,Nuclease) 该酶来源于米曲霉茵，催化反应通常由 Zn 2+激活，并在酸性 pH（ 4.0-4.5）条件下进 行，其特征是：（ 1）降解单链 DNA 或 RNA，包括 2）降解反应的方式为内切和外切； (3) 酶量过大时会伴有双链核酸的降解。因为该酶的双链降解活性比单链低 7.5 万倍，因此在 DNA 重组及分子生物学研究中， S1 核酸酶常用来切平突出的单链末端以及制作 S1 图谱。 (1)测定真核基因中间隔子序列位置； (2)去除 DNA 片段中突出的单链尾巴； (3)打开 cDNA 合成时形成的发夹环结构 7、 Southern blot 的原理及应用（谈谈核酸杂交的基本原理，并举例说明 Southern blot 在基因工程中的应用。） 1）核酸分子杂交的原理： 碱基的互补配对，双链 DNA 在一定条件下能够变性和复性。 Southern 杂交技术由 E. Southern 于 1975 年发明，它现在是基因分离和鉴定中不可缺少 的一个重要手段。待分析的基因组 DNA 或其它 DNA 首先用一种或几种限制性核酸内切酶 消化，消化后的 DNA 片段通过琼脂糖凝胶电泳按照分子量的大小进行分离，凝胶经碱变性 处理，将 DNA 分子变性成单链，经毛细管作用或物理方法将凝胶中的单链 DNA 分子从胶 上转移到固相支持物上（一般使用的是尼龙膜和纤维素膜）。然后用标记的 DNA 或 RNA 探 针对附着于膜上的 DNA 进行杂交来检测这些被转移的 DNA 片段，与探针有同源性的 DNA 片段在膜上的位置可以通过特定的检测方法如放射自显影或显色而显示。 Southern 杂交能否检出杂交信号取决于很多原因 ,其中包括目的 DNA 在总 DNA 中所占 的比例、探针的大小和比活性、转移到滤膜上的 DNA 量以及探针与目的 DNA 之间的配对 情况等。 2） Southern Blot 应用： （ 1）可用来检测基因序列的同源性，可以分析转基因动植 物 的转基因在基因组上出现的情况，可以确定外源基因在植物中的组织结构，外源 DNA 整合的位置及拷贝数，转基因植株 F1 世代外源基因的稳定性等 （ 2） 遗传病诊断， DNA 图谱分析，检测样品中的 DNA 及其含量， PCR 产物分析等； 绘制物理图，同源性、重组、变异的研究 （ 3） 基因工程中的应用：可以精确的检验出微量 DNA 分子，检测转基因细胞中目标 DNA 的含量以及检验出转基因是否成功等等。 老师的举例：通过对小麦的异源多 倍体进行 southern blot，判断对 probe 对应的 DNA 进行物理定位。 3）如何判断转移是否完全： 转移 DNA 以后将胶重新染色 ,看是否还有 DNA 在胶上 .片断太大 ,转移时毛细管作用失 败即溶液不是通过胶上移等 8、 基因文库（ 概念、 用途） 答： 基因文库：用重组 DNA 技术将某种生物细胞的总 DNA 或染色体 DNA 的所有片断随机 地连接到基因载体上 ,然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的 无性繁殖系（克隆），在制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的 情况下，这一组克隆的总体就被称为某种生物的基因文库。同一定义也适用于某种生物 的线粒体 DNA 或叶绿体 DNA 的基因文库。由于制备 DNA 片段的切点是随机的，所以每一 克隆内所含的 DNA 片段既可能是一个或几个基因，也可能是一个基因的一部分或除完 整基因外还包含着两侧的邻近 DNA顺序。 基 因文库与基因库的概念不同。基因库是指 某一生物群体中的全部基因。基因文库与基因克隆的概念也有区别，基因克隆是只包含 某些特定基因或 DNA 片段的克隆。基因文库中包含着为数众多的克隆，建成后可供随 时选取其中任何一个基因克隆之用。 利用：从基因文库中筛选某一克隆的常用办法是分子杂交。首先把属于一个文库的细菌 或噬菌体以较低密度接种在培养皿上以取得相当分散的菌落或噬菌斑，然后用硝酸纤维 滤膜吸印，使培养皿和滤膜的相对应的位置上具有相同的克隆。同时另行制备供分子杂 交用的探针。为了筛选真核生物的某种基因，常从它的转录产物 mRNA 经反向转录（见 中心法则）合成相应的互补 DNA(cDNA)，再加入用 32P 标记的核苷三磷酸，用 DNA 多聚 酶切口移位方法制成有同位素标记的探针。把探针 DNA 和硝酸纤维滤膜上的菌落或噬菌 体分别进行变性处理，然后进行分子杂交。再将 X光底片覆盖在经过处理的滤膜上以进 行放射自显影。在培养皿上找出和 X 光底片上的黑点相对应的菌落或噬菌斑。这些菌落 或噬菌体中便包含着所需要的基因，经过扩增便能得到大量的细菌或噬菌体，从中可以 分离出所需基因的 DNA 片段 应用：建立和使用基因文库是分离基因，特别是分离高等真核生物基因的有效 手段。如 果一个哺乳动物的基因组是 3109 碱基对，直接从细胞中提取并分离出某一特定基因 的 DNA 片段在技术上是很困难的。但是在基因文库中，不同的 DNA 片段都分别在不同 的克隆中扩增了，只要有该基因的探针存在，则从许多克隆中筛选一个所需的克隆是一 项比较简单的工作。此外基因文库中被克隆的 DNA 都是基因组中各种随机的顺序片段， 某些 DNA 片段还包括基因外部的邻近的甚至互相跨叠的序列，所以基因文库特别有利 于研究天然状态下基因的顺序组织。例如曾从人的基因文库中分离得到含有血红蛋白 链基因的克隆，从中取得该基因的 DNA并进行分析，发现人的 和 链基因是连锁的， 二者之间相隔几千个碱基对，而且在它们内部都有两个内含子。 基因文库还可以应用在个体发育的研究中。例如从芽孢杆菌的正在形成芽孢的菌体中分 离 mRNA，并用同位素标记做成探针，用这些探针可以从芽孢杆菌的基因文库中分离出只 在芽孢形成过程中活动的基因，有助于对发育过程中基因调控进行研究。 基因文库也可以应用在高等生物，例如人的基因定位工作中。基因文库在生产实际中也 是取得所需要的基因的一种重要方法。 基因文库（ gene library)或 DNA 文库：在细菌中增殖来自某一生物的 染色体基因组 DNA （或来自所有不同的 mRNA 种的每一种 cDNA 分子）所形成的的全部 DNA 片段之集合体。 有基因组 DNA 文库 (克隆 )和 cDNA 文库 (克隆 )。 基因组 DNA 文库构建 载体 DNA 片段的制备 DNA 分离纯化限制酶切 脱磷酸化反应 供体 DNA 片段的制备 总 DNA 分离纯化物理切割法或机械搅拌或限制性核酸内切酶酶切法（内切酶 Sau3A 进行局部消化，可得到 10-30kb 的随机片段）分离特定大小 DNA 片段 DNA 片段大小分离和富集 琼脂糖凝胶电泳 和蔗糖梯度离心技术 载体与基因组 DNA 大片段的连接 cDNA 克隆文库 来自某一生物的某种组织的所有不同的 mRNA 合成的 cDNA 分子再将 cDNA 重组到载体 上，导入大肠肝菌细胞增殖。 (1)cDNA 文库的构建 A、分离总 RNA，然后从中纯化 mRNA。 B、合成第一 cDNA 链。 C、将 mRNA-DNA 杂交分子转变为双链 cDNA 分子。 D、将合成的双链 cDNA 重组到载体上，导入大肠肝菌 细胞增殖。 （ 2） cDNA 克隆的优越性 A、一些 RNA 病毒基因克隆的唯一手段。 B、比 DNA 文库小的多，容易构建 ,筛选较简单。 C、假阳性几率低。 D、生产表达产物蛋白质。 E、功能研究 ,不含内含子序列 ,可以在细菌中直接表达（一般选 用的载体都是表达型的。