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实验一 细菌涂片的制备及革兰氏染色1、 制备细菌染色标本时应注意什么？ 涂片不要太厚，要均匀，固定的时候一定按照要求，快速，染色脱色时间要控制好2涂片 2、 固定的意义何在？固定时应注意什么问题 ？ 固定 目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。 3、 革兰氏染色的原理及染色成败的关键？ 机制：结果为阳性（紫色）和阴性（红色）两大类，与细菌细胞壁的结构组成有关。细菌经结晶紫初染和碘液媒染之后，所有细菌都染上不溶于水的结晶紫与碘的复合物，呈深紫色；阴菌的细胞壁含脂类较多，当以95%乙醇脱色时，脂类被乙醇溶去，而肽聚糖少，且交联疏松，不易收缩，在细胞壁中形成的孔隙较大，复合物极易被乙醇溶解洗脱，最后被红色的染料复染成红色；阳菌与阴菌相反，复合物不能脱出，经红色染料复染后仍为紫色。 （碱）结晶染色碘媒染酒精脱色可脱为G+不脱为G 关键：革兰氏染色四大基本步骤：结晶紫初染碘液媒染乙醇脱色沙黄复染其中乙醇脱色是关键因为如果脱色过度，有可能会使革兰氏阳性菌呈假阴性如果脱色不够，有可能使革兰氏阴性菌呈假阳性实验二 培养基的制备 1、 为什么在校正培养基pH时,少量培养基时用0.1摩尔每升氢氧化钠,而大量时用1摩尔每升氢氧化钠? 少量培养基在校正时，需要的氢氧化钠少，所以用浓度底的校正的结果会更准确。而大量的就需要大量的，如果还用浓度低得话，结果会准确，但是工作量极大，而换1mol/L的话，结果误差不会很大，综合考虑：在校正大量的培养基时，应使用浓度高的。 2、 为什么肉汤培养基在高压灭菌之前ph要略调高些？ 牛肉膏中有些物质在加热后会分解出酸性物质导致pH下降。因此初始pH应比需要值高0.2左右。 3、 试述普通肉汤和琼脂培养基的主要用途？ 琼脂培养基是在实验室做实验时专门配置的，一般植物源琼脂培养基适用于培养真菌一类的微生物；动物源琼脂培养基适用于细菌类微生物培养。动物源琼脂培养基主要成分与肉汤差不多，只是培养基可以根据实验的要求进行调整营养成分，以适应实验要求。琼脂培养基一定会成“冻”，肉汤不一定。实验三 细菌分离培养、移植及培养特性观察 注意事项 1、接种环必须做得圆整平滑，使用前后须烧灼灭菌。 2、接种培养基时应严格无菌操作，要尽一切可 能防止外界微生物的进入。 3、选择适宜的培养基，如果培养基选择不当， 则材料中的细菌就可能难以分离。 4、要注意记录好接种名称及时间。思考题 1、 分离培养的目的是什么?何谓纯培养? 分离培养的目的是：主要是在含多种细菌的病料或培养物中挑选出某种细菌。在分离培养时应注意：选择适合于所分离细菌生长的培养基、培养温度、气体条件等。 纯培养:把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养。2、 在挑取固体培养物上的细菌作平板分区划线 时，为什么在每区之间都要将接种环上剩余的细菌烧掉? 在对下一个区划线之前灼烧接种环，可以杀死接种环上剩余的细菌，这样，当接种环再从上个区拉出一条线的时候，环上的细菌数目就少了很多，经过这样的灼烧、划线，环上的细菌数目逐渐减少，最终达到分离出单菌落的目的。 3、 培养皿培养时为什么要倒置? 原因 1：防止凝结在皿盖上的水蒸气流到培养基表面导致染菌！ 2：有利于菌种利用培养基营养，加快生长速度！实验四 细菌的生化实验 1.解释所做生化试验的原理 （1）细菌生化试验 各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用。用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。（2）糖（醇）类发酵试验 不同的细菌含有发酵不同糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同。其产生的代谢产物亦不相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来判定。在配制培养基时预先加入溟甲酚紫P HS . 2 （黄色）一6 . 8 （紫色） ，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体产生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。 （3）甲基红试验（该试验简称MR 试验） 很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH 降低到4 . 2 以下，这时若加甲基红指示剂呈现红色。因甲基红指示剂变色范围是pH4 . 4 （红色）一pH6 . 2 （黄色）。若某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，但很快将丙酮酸脱梭，转化成醇等物，则培养基的pH 仍在6 . 2 以上，故此时加入甲基红指示剂，呈现黄色。（4）大分子物质代谢实验 靛基质（口引睬）试验 某些细菌，如大肠杆菌，能分解蛋白质中的色氨酸，产生靛基质（叫睬），靛基质与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成玫瑰色靛基质（红色化合物）。 硫化氢试验 某些细菌能分解含硫的氨基酸（肌氨酸、半肌氨酸等），产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。为硫化氢试验阳性，可借以鉴别细菌。 明胶液化实验 某些细菌具有胶原酶，使明胶被分解，失去凝固能力，呈现液体状态，是为阳性。淀粉水解试验（在紫外诱变中做，本实验不做） 细菌对大分子的淀粉不能直接利用，须靠产生的胞外酶（淀粉酶）将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖（或麦芽糖），再被细菌吸收利用，细菌水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。 （5）有机酸盐及氨盐利用试验 柠檬酸盐利用试验 柠檬酸盐培养基系一综合性培养基，其中柠檬酸钠为碳的唯一来源。而磷酸二氢按是氮的唯一来源。有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的溟廖香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌，在该培养基上不生长，培养基不变色。2、生化试验在细菌鉴定中的作用和意义 生化实验在细菌的鉴定中意义很大,因为要想确定一种菌具体属于哪一种就要通过一系列的生化实验几菌落形态和显微观察来确定,生化实验是非常重要的一部分. 但其实意义不是很大，一般是根据伯氏细菌手册看的，不过现在基本上都是用16S RNA来鉴定，要精确一些。实验五 药物敏感试验 1、 圆纸片药物敏感试验操作注意事项 药物不能靠的太近，应尽量均匀分布在纸片上。 2、 试述药物敏感试验的意义 药物敏感试验是为了对临床标本中分离的菌株选择何种药物进行治疗有效而进行的一种试验。常用的有纸片扩散法和微量稀释法。根据试验结果可以判断何种药物对该菌株治疗有效（即敏感），何种药物对该菌株治疗无效（即耐药）。实验六血凝及血凝抑制试验 1、 病毒凝集红细胞是不是一种特异的抗原体反应？为什么？ 不是，有些病毒具有凝集红细胞的能力，不需要与抗体结合即可以凝集血细胞，是非特异性的。还有一些病毒，当与抗体结合后，可以引起红细胞凝集反应，称为血凝试验，可用于特异性检查抗原或抗体。2、 HI试验是不是特异的抗原抗体反应？为什么？ 是 ，因为HI实验本身就是一种测定抗原或抗体的技术，抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。 这种反应即可在机体内进行，也可以在机体外进行。抗原抗体反应的过程是经过一系列的化学和物理变化，包括抗原抗体特异性结合和非特异性促凝聚两个阶段，以及由亲水胶体转为疏水胶体的变化实验七凝集试验注意事项1、每次试验应设标准阳性血清、标准阴性血清和生理盐水对照。2、抗原保存在28，用前置室温3060min，使用前摇匀，如出现摇不散的凝块，不得使用。3、被检血清必须新鲜，无明显的溶血和腐败现象。4、平板凝集反应温度最好在35min内记录结果，如反应温度偏低，可于58min内判定。5、平板凝集反应适用于普查初筛，筛选出的阳性反应血清，需做试管凝集试验，以试管凝集的结果为被检血清的最终判定.6、结果判为可疑时，隔23周后采血重做。阳性畜群，重检时仍为可疑，可判为阳性。对同群中既无临床症状又无凝集反应阳性者，马、猪重检仍为可疑，判阴性；牛、羊重检仍为可疑者，可判为阳性，或以补体结合反应核对。思考题1、平板凝集试验和试管凝集试验的原理、操作方法及结果判定。原理： 1.平板凝集试验 颗粒性抗原在体外一定条件下（有电解质存在，pH、温度恰当）与相应抗体相遇，二者发生特异反应，出现肉眼可见的凝集物。参加凝集反应的抗原称为凝集原，而相应的抗体称为凝集素。 2.试管凝集试验 试管法直接凝集试验是将已知的颗粒性抗原悬液定量地与一系列倍比稀释的待检血清等量混合，静置一定时间后，根据各管的凝集程度，判断待检血清中抗体的效价,常用于半定量检测。 操作方法： 加样 每份血清用4支试管，另取1支为生理盐水对照，先加生理盐水，然后以1ml注射器吸取待检血清0.2ml加入第1管充分混匀，吸1.5mL弃之，再吸0.5mL加入第二管，混匀后加入第三管，依次至第4管，混匀后弃0.5mL。第5管不加血清，加0.5mL生理盐水 、 加抗原 各管加入以生理盐水稀释20倍的布氏杆菌试 管抗原0.5mL。 感作 各管加完后震荡，将其置37恒温箱作用4小时，拿出置室温18-24小时，观察结果。 结果判定：+: 100%菌体凝集，液体全透明、菌体伞状沉淀。 +：75%菌体凝集，液体略混浊，菌体大部分呈伞状沉淀。 +：50%菌体凝集，液体不甚透明，管底有明显的凝集沉淀。 +：25%菌体凝集，液体不显透明，管底有少量颗粒沉淀。 -：阴性，液体不透明，管底无凝集，有时有少量沉淀摇之均匀混浊。 以出现“+”以上凝集的最高血清稀释倍数为凝集价。人和大家畜凝集价1：100以上为阳性，猪、羊、小家畜1：50以上为阳性；大家畜1：50、小家畜1：25为可疑。可疑的半个月后重检，仍可疑，按具体情况而定（阳性群，判阳性；阴性群，判阴性）。 3、 影响凝集试验的因素主要有哪些? 1 温度。温度影响酶的活性2 时间。随着时间的延长细胞聚集程度加大3 反应底物4 细胞类型5 反应培养板的质量6 人为因素4、 凝集试验中为什么要设阳性、阴性血清及抗原对照？ 某此细菌或病毒当制成细菌或病毒悬液时很不稳定，在没有特异性抗体存在下，亦可发生凝集，谓之自凝。某些理化因素亦可引起非特异性凝集，pH降至3.0以下时, 即可起抗原悬液的自凝, 称为酸凝集。因此，试验时必须设置阳性血清、阴性血清和抗原等对照是为了排除自凝干扰。实验八 沉淀试验 注意事项 1、倒琼脂板时，要求均匀、平整、薄厚一致，无气泡。 2、琼扩试验打孔时不要把琼脂层与平皿脱离，孔的边要圆整光滑，边缘不要破裂，要补底处理。 3、滴加试剂时不能产生气泡而影响试验结果。4、加样时每加完一个样品必须更换滴头。 思考题 1、 环状沉淀试验和琼脂扩散沉淀试验的实验原理是什么？操作时应注意事项是 什么？ 可溶性抗原与相应抗体结合，在有适量电介质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀试验。沉淀反应的抗原可以是细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液、病毒的可溶性抗原、组织渗出液、多糖、蛋白质、类脂等。 测定时将加热溶化的琼脂或琼脂糖浇至玻片上，等琼脂凝固后，打多个小孔，将抗原和抗体分别加入小孔内，使抗原和抗体在琼脂板上相互扩散。当二个扩散圈相遇，如抗原和抗体呈特异性的结合且比例适当时，将会形成抗原抗体复合物的沉淀，该沉淀可在琼脂中呈现一条不透明的白色沉淀线。2、 琼脂扩散沉淀试验结果为什么有时会出现沉淀带完全交叉现象？ 若二孔中抗原不同，当抗血清中分别含有与抗原相应的抗体时，则出现沉淀带完全交叉现象 3、 琼脂扩散沉淀试验在实际中的应用价值？ 本试验主要用于检测标本中各种免疫球蛋白和血清中各种补体成分的含量，敏感性很高。通过该试验，用特异性抗体鉴定抗原，或反之用已知抗原鉴定抗体。实验九：荧光抗体试验 注意事项 1、如果怀疑是急性猪瘟，可用活体采扁桃体进行 荧光染色。 2、待检的组织病料（扁桃体、肾、淋巴结等）必 须新鲜，如不能及时检查，应冷冻保存。 3、制备标本的载玻片越薄越好，应无色透明，用 前洁净处理并用绸布擦净；切片或组织触片尽可 能薄，太厚不易观察而影响结果的判定。 4、对含病毒较低的病理组织需先在细胞培养上培 养一段时期后再用荧光抗体检测病毒抗原，可提 高检出率。5、观察标本片前荧光显微镜一般需预热15分钟， 在暗室内进行，荧光显微镜安装调试后，最好固 定在一个地方加盖防护，不再移动。 6、标本染色后应立即观察，放置时间过久荧光会 逐渐减弱，如不能及时观察可将标本放在聚乙烯 塑料袋中于4保存，可延长荧光保持时间。 7、不能长时间在同一个视野下观察，一般标本在 高压汞灯下照射超过3min即有荧光减弱现象。 思考题 1、 荧光抗体染色的基本原理及实验结果的判定。 基本原理：荧光抗体技术就是用不影响抗体活性的荧光素对抗原或抗体进行标记，当标记物与相应的抗原或抗体结合后，就会形成带有荧光素的复合物，在荧光显微镜下，由于受高压汞灯光源激发的特定波长的光照射，荧光素就会发出明亮的荧光，这样就可以对相应的抗原或抗体分析示踪。 结果判定：黄绿色闪亮荧光 黄绿色的亮荧光 黄绿色荧光较弱 仅有暗淡的荧光 无荧光 2、 请举例说明该技术在动物疫病诊断中的作用？ 用猪瘟荧光抗体染色检测猪瘟病毒，特异性强、准确率高，实验十、酶联免疫吸附试验注意事项 1. 从冷藏环境中取出的试剂盒应平衡至室温后方 可使用。 2. 未使用的预包被板条应置于封口袋，28保 存。 3. 浓缩液用蒸馏水或超纯水稀释，若发现有出现 结晶，请放置37至溶解后使用。 4. 滴加试剂时，应先摇匀，并弃去12滴后， 垂直滴加。 5. 使用完毕后，将所有样品、洗涤液和各种 废物都进行灭活处理。 6. TMB（底物B）不要曝露于强光，避免接触 氧化剂。 7.待检样品较多时，应先使用血清稀释板稀释 完所有要检测血清，再将稀释好的血清转移 致检测板，使反应时间一致。 8. 结果判读请在15分钟内完成。 9. 不同批号的试剂组份不可混用。 思考题 1. 在实际操作中，你认为有哪些因素可以影响ELISA定量检测的结果？ 一) 操作前应对实验的物理参数有充分的了解，如环境温度(保持在18 C25)、反应孵育温度和孵育时间、洗涤的次数等，要先查看水育箱温度，是否符合要求。 (二) 正确使用加样器加样器应垂直加入标本或试剂，避免刮擦包被板底部。加样过程中避免液体外溅，血清残留在反应孔壁上，加样器吸头要清洗干净，避免污染，加样次序要与说明书一致，否则可导致结果错误，实验重复性差。 (三)手工洗板加洗液时冲击力不要太大，洗涤次数不要超过说明书推荐的洗涤次数 (四)要保证加液量一致 我们在使用时感觉滴瓶加液不如加样器好，滴瓶不易控制加液量不准，造成显色不统一，判断错误。(五)显色液量不可过多 加样的工作环境不能处于阳光直射的环境下，加显色系统后要避光反应，显色液量不能过多，以免显色过强。 2. ELISA试验的优点及应用前景？ 优点： ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化、特异性强 应用前景： 1、ELISA在饲料安全检测中的应用 2、ELISA用于农药残留的检测 3、农药的检测： 4、ELISA在疾病诊断中的作用 5、ELISA在兽医诊断中的应用
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