乙型肝炎病毒核苷(酸)类似物耐药的检测.ppt

乙型肝炎病毒核苷(酸)类似物耐药的监测,缪晓辉2009.5,一、HBV耐药的有关定义二、各种耐药检测技术的评价三、需要重视的几个问题,一、HBV耐药的有关定义,病毒学突破（virologicbreakthrough）病毒反跳（viralrebound）生化学突破（biochemicalbreakthrough）HBV基因型耐药（genotypicresistance）HBV表型耐药（phenotypicresistance）临床耐药（clinicalresistance）,HBV耐药的有关定义,病毒学突破（virologicbreakthrough）指在核苷类药物治疗过程中，患者的血清HBVDNA水平一度被抑制，但在继续治疗中血清HBVDNA水平与最低值相比上升或超过1个log10（10倍）。,HBV耐药的有关定义,病毒反跳（viralrebound）指核苷类药物治疗过程中患者的血清HBVDNA水平一度被抑制，但在继续治疗中血清HBVDNA升高至2104IU/mL或高于治疗前水平。,HBV耐药的有关定义,生化学突破（biochemicalbreakthrough）指在核苷类药物治疗过程中血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平一度复常，但在继续治疗中血清ALT水平又再次升高。肝脏生活指标很多，但是在此仅指ALT。,HBV耐药的有关定义,HBV基因型耐药（genotypicresistance）指HBV基因组中的某些位点发生改变，导致这种药物对HBV的抑制作用下降或消失。这种HBV基因变异与HBV的耐药性有直接因果关系，通过这些变异位点的检测可判断HBV有无耐药性。,HBV耐药的有关定义,HBV表型耐药（phenotypicresistance）通过体外细胞培养方法，直接测定HBV对某种药物的敏感性，或者在体外直接测定HBV聚合酶的活性，敏感性的降低或酶活性的下降均表明有耐药，即表型耐药。通常以IC50来评估IC505倍:敏感IC50在510倍:部分耐药IC5010倍:耐药,HBV耐药的有关定义,临床耐药（clinicalresistance）指临床出现病毒复制不能被抑制，或HBV复制一度被抑制后又出现HBVDNA反跳，同时伴有ALT升高，或肝炎复发的其他临床证据。,二、各种耐药检测技术及评价,病毒学反跳或突破的监测HBV基因型耐药监测HBV表型耐药检测临床耐药监测,病毒学反跳或突破的监测,基于对血清HBVDNA载量的动态监测需重视以下三点：1.HBVDNA载量检测手段的敏感性2.检测技术的可靠性和稳定性3.监测的间隔时间,HBV基因型耐药监测,时机非必须不主张常规、广泛应用,基因型耐药相关变异的命名,基因型耐药相关变异在HBV多聚酶序列中的位置,HBV基因型耐药的主要技术,碱基序列分析法直接测序克隆测序聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)反向杂交分析技术（INNOLiPA）基因芯片技术实时荧光定量PCR技术探针定点突变PCR技术引物末端碱基定点突变扩增技术熔解曲线法基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS),直接测序法,HBVYMDD变异直接测序结果图谱,直接DNA测序的局限性,1.设备贵、技术高、耗材、费时。2.必须有充足目的基因片段。3.突变株比例小于20%时，由于竞争抑制作用不能被扩增。直接测序法检测HBVYMDD变异1.JPG,克隆测序法,克隆测序法,优点：1.有助于发现混合株并可大致确定不同序列毒株之间的相对比。2.提高了检测的灵敏度。局限性：1.技术难度较高。2.检测周期更长。3.检测的费用大大增加。,碱基变异可能导致：原有位点消失产生新的位点识别位点移位,利用错配引物使PCR产物中产生特异的酶切位点,结果:酶切片段长、短变化和多、少变化,聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP),限制性内切核酸酶的作用,它们能识别DNA的特异序列，并在识别序列内或其旁切割双链DNA。如：,NdeI限制酶的识别序列和切割位点：,-CATATG-GTATAC-,NlaIll限制酶的识别序列和切割位点：,-CATGNNN-GTACNNN-,PCR-RFLP检测HBVYMDD变异,错配引物设计,PCR-RFLP检测HBVYMDD变异,PCR-RFLP检测HBVYMDD变异,PCR-RFLP技术的评价,优点：简单、广泛易开展。缺点：1.限制性内切酶种类有限。2.错配引物将导致退火温度降低、非特异条带增多。3.引物非完全匹配，可能导致扩增效率降低、检测敏感的下降。,反向杂交分析技术（INNOLiPA）,INNOLiPA诊断HBVYMDD变异,DNA芯片技术,Scanner,microarray,“Hybridize”,arrayer,MicroarrayfabricationSamplepreparationMolecularhybridizationDetectionandanalysis,DNA芯片技术诊断HBVYMDD变异,DetectionofYMDDMotifMutantsbyOligonucleotideChipsinLamivudine-UntreatedPatientswithChronicHepatitisBVirusInfection。JKoreanMedSci2004;19:541-546.,DNA芯片技术,优点局限性大通量技术和设备的要求高快速检测成本高灵敏度高可平行检测,实时荧光定量PCR在基因变异中的应用,探针定点突变PCR技术-Taqman-MGB探针引物末端碱基定点突变扩增技术高分辨熔解曲线法,Taqman-MGB探针定点突变PCR技术,Taqman-MGB探针技术检测YMDD变异,HBVDNA105copies/mlW:M=1:1,HBVDNA105copies/mlW:M=10:1,HBVDNA105copies/mlW:M=10:1,：W,：M,探针定点突变PCR技术,优点不足灵敏度高需要相对较贵的荧光PCR仪特异性好需要多条荧光探针，成本高费时短影响因素多，存在一定误判,引物末端碱基定点突变扩增技术,引物末端碱基定点突变扩增技术检测YMDD变异,熔解曲线法检测YMDD变异,特异性探针，其Tm值不同,溶解曲线分析,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)原理,MALDI-TOFMS检测HBVYMDD变异的原理,酶切分子量.JPG,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS),优点：高灵敏度、准确度、分辨率能发现相对比例小于1%的变异株。局限性：设备昂贵，目前国内难以用于临床检测。,HBV耐药不同检测技术的比较,AdvancesinMolecularDiagnosisofHBVInfectionandDrugResistance。Int.J.Med.Sci.20052(1)：8-16,1Sensitivityherereferstothelowestlevel(%)atwhichanassaycandetectmixturesofmutantandwild-typevirus.2Informationcontentisconsideredasameasureofatestsabilitytoprovidebroad,relevantinformationaboutpossiblenewmutations.3Updateabilityassessestheeaseatwhichatestcanbedaptedtoincorporatethedetectionofanewmutation.na,notapplicable.nd,notdetermined.,HBV表型耐药检测,有两种途径：1.细胞外HBV聚合酶活性分析。2.细胞药物敏感性实验。,细胞外HBV聚合酶活性分析,目前常用的研究HBV聚合酶活性模型是将HBV基因组插入杆状病毒载体，继而转染昆虫细胞而表达HBV颗粒，应用亲和层析法纯化HBV颗粒后，在细胞外评价药物对聚合酶活性的影响。,细胞外HBV聚合酶活性分析,细胞药物敏感性实验,该方法类似于细菌药物敏感试验。目前多采用病毒载体将含有被检测的含HBV变异位点的全基因组导入肝细胞源性细胞株，然后将各种浓度的核苷类药物加入培养液，经过一定时间培养后检测细胞上清中的HBVDNA含量。,细胞药物敏感性实验,细胞药物敏感性实验,该技术在操作上非常繁琐，目前仅限于研究之需，主要用于药物开发研究，尚不能用于常规临床分析。,临床耐药监测,YMDD变异前后病毒载量和ALT的变化,HBVMDD变异与病毒学突破,判断临床耐药时的建议,1.结合核苷类药物的应用史、起始病毒载量、是否合并其他肝病等。2.注意甄别依从性不良。3.结合基因变异位点。,三、需要重视的几个问题,慎重对待天然耐药的结论。不要过分依基因型耐药检测技术。正确对待基因分型技术。,YMDD自然变异的几组数据,AkarsuM等采用InnoLipa法检测71例未经抗病毒的成年慢性乙肝携带者，结果有13例检测到YMDD变异株。LeeCZ等采用引物末端碱基定点突变扩增技术对28例拉米夫定治疗前的CHB患者血清进行了YMDD变异毒株检测，发现有16例（57.1%）存在YMDD自然变异毒株。日本Kobayashi等检测18例无症状HBV携带者,发现5例YMDD变异,占27.78%。,本实验室关于YMDD自然变异的2组数据,196例CHB患者中，检出存在YMDD变异毒株者共21例，检出率为10.7%。其中YVDD阳性20例，YIDD阳性1例，YVDD和YIDD同时阳性者0例。,183例CHB患者中，检出存在YMDD突变毒株者共40例，检出率为21.86%。其中YVDD阳性36例，YIDD阳性3例，YVDD和YIDD同时阳性者1例。,VS,不要过分依基因型耐药检测技术,基因型耐药变异并非必须。目前我国尚无SFDA批准的商品化试剂盒或被普遍认可的检测技术。,正确对待HBV基因型与核苷类似物疗效之间的关系,基因型是一种人为的分类方式。HBV的基因型与各种核苷类药物的疗效之间的关系还没有确定的结论。P区基因的变异对S区基因的影响。,结语,加深认识适时监测及时发现正确管理,谢谢！,