基因的体外转录和翻译.ppt

2020年5月20日星期三,1,基因的体外转录和翻译,2020年5月20日星期三,2,什么是基因的体外转录和翻译,基因的体外转录和翻译是20世纪70年代发展起来的一项分子生物学和细胞生物学实验技术，是研究离体条件下(非细胞体系)基因表达情况的理想体系。,2020年5月20日星期三,3,基因表达包括：转录和翻译两个过程。,基因表达的调控包括：染色体结构的调节、DNA结构的调节、转录过程的调控、转录后的调控、翻译过程的调控及翻译后的调控。,2020年5月20日星期三,4,基因体外转录和翻译的作用：为研究基因转录和蛋白质翻译提供了一个十分理想实验体系和技术平台及找到了一个研究与探讨转录和翻译这两个复杂的现象的重要手段和方法。,2020年5月20日星期三,5,第一节基因的体外转录,一、基因体外转录的目的和意义基因的体外转录体系最早由Pelham和Jakson于1976年创立的，经很多实验室的不断修订和改进，现已成为一项成熟的分子生物学和细胞生物学技术，已被多家试剂公司提供标准的实验程序。,2020年5月20日星期三,6,基因体外转录体系在分子生物学和细胞生物学研究中的用途和意义：,1、快速检测目的基因的转录情况；,2、分析转录因子调节基因转录的过程；,3、分析启动子序列的活性；,4、分析转录因子、DNA结合蛋白和RNA剪切因子的组成和作用；,5、染色质结构调整与基因转录的关系；,6、制备RNA探针。,2020年5月20日星期三,7,一、基因体外转录的基本原理,基本原理：以DNA为模板，在无细胞体系中一系列转录因子的作用下经RNA聚合酶合成RNA的过程。,模板,质粒DNA,线性DNA,核小体形式存在的DNA,2020年5月20日星期三,8,能用于体外转录的质粒载体,转录的必要条件：无论是真核细胞的转录体系还是原核细胞的转录体系，基因转录时都必须有启动子序列，且该序列能被转录体系识别。,原核细胞体外转录体系常用的启动子有T3、T7及SP6启动子。,真核细胞体外转录体系除需启动子，增强子等顺式作用元件外，还需各种反式作用元件的参与。,2020年5月20日星期三,9,基因体外转录体系,DNA模板：含有转录启动子及必要的调控序列(起始和终止序列等)的DNA及为研究基因转录调控的需要,在体外组装成的核小体链(注意避免RNase的污染)。,2020年5月20日星期三,10,细胞核抽提物：DNA转录由RNA聚合酶、各种转录因子及必要的环境条件等，这一切必需由细胞提供。常用于制备细胞核抽提物的细胞有酵母细胞、兔网织红细胞和Hela细胞,细胞核抽提物的制备：,1、一般方法,优点：细胞核完整、内含物丰富,缺点：在分离的细胞核中可能存在少量细胞质成分,2020年5月20日星期三,11,(1)收集细胞：取5106/ml的培养细胞20ml，1500rpm离心5min，用新配制的0.01mol/LPBS洗涤，收集细胞。,(2)低渗液裂解细胞并纯化细胞核：将收集的细胞迅速加入原体积1/10的低渗缓冲液0.01mmol/LHEPES(4羟基乙基哌嗪乙磺酸)pH7.9,10mmol/LKCl，1.5mmol/LDTT(二硫苏糖醇)，0.2mmol/LPMSF(苯甲基磺酰氟)，冰浴30min，用玻璃匀浆器匀浆，3000rpm离心15min得细胞核沉淀。,2020年5月20日星期三,12,2020年5月20日星期三,13,(3)裂解细胞核：向细胞核沉淀中加入2倍体积的低盐缓冲液(20mmol/LHEPES，pH7.9，25甘油，1.5mmol/LMgCl2，20mmol/LKCl，0.2mmol/LEDTA，0.2mmol/LPMSF，0.5mmol/LDTT)，冰浴10min，用玻璃匀浆器匀浆。滴加入2倍核沉淀体积的高盐缓冲液冰浴轻轻搅拌30min。,2020年5月20日星期三,14,(4)收集核提取物：25000g离心30min，收集上清液后，用缓冲液透析2h后，4，25000g离心20min，上清液置-70保存。,(5)核提取物的蛋白定量：核抽提物总蛋白浓度采用Bradford法测定，以牛白蛋白为参照。,2020年5月20日星期三,15,附：Bradford法测蛋白含量1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。,2020年5月20日星期三,16,考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。,2020年5月20日星期三,17,Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。,2020年5月20日星期三,18,（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。,2020年5月20日星期三,19,（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K、Na、Mg2离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。,2020年5月20日星期三,20,（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。,2020年5月20日星期三,21,2、精胺亚精胺混合物改进法,优点：分离到的细胞核比较纯净,缺点：分离过程中一些特殊的试剂破坏了细胞核膜，造成核内容物的部分流失及操作过程中精胺易使DNA模板产生沉淀,2020年5月20日星期三,22,过程：,收集细胞：收集一定数量的培养细胞，300g离心5min，沉淀用分离液清洗2次。,裂解细胞纯化细胞核：沉淀中加入预冷的匀浆液1/10(原体积)，冰浴10min后，匀浆，镜检，至90%细胞破碎，细胞核游离出来为止，550g离心8min。,2020年5月20日星期三,23,收集细胞核：沉淀用细胞分离液洗1次，550g离心8min，收集细胞核沉淀。,裂解细胞核：取沉淀重悬于原体积1/100的细胞核裂解液中，搅拌30min，100000g离心30min。,2020年5月20日星期三,24,核提取物的浓缩：测上清体积，按1ml上清液加入0.33g硫酸铵粉末。510min内缓慢加入并搅拌30min。100000g离心15min沉淀蛋白。沉淀物溶于1/200原体积的透析缓冲液，4透析45h。,2020年5月20日星期三,25,核提取物的保存：高速离心10min。去除不溶物，测定蛋白浓度，用预冷的小管分装。提取物可在液氮中冻存，80可保存数月。如有沉淀，可高速离心10min，去除不溶物。,3、分离得到的细胞核比较纯且没有核蛋白的流失。,2、得到的蛋白质具有转录活性。,1、含有细胞核中的所有可溶性蛋白。,制备细胞核提取物时应注意：,2020年5月20日星期三,26,体外基因转录反应,体外基因转录一般用硅化的1.5ml塑料管，在2432条件下进行，为了保证产物的稳定，反应体系中必须加入RNase抑制剂，终止反应时，可加入蛋白酶以降解核提取物中的RNase。同时加入酵母tRNA作为产物RNA的载体起到保护作用。反应体系中以四种核苷酸为底物，其中一种是被标记的。,2020年5月20日星期三,27,用提纯的RNA聚合酶进行体外转录,用细胞核提取物进行体外转录,用RNA聚合酶III进行体外转录,体外转录所用的酶及体系,2020年5月20日星期三,28,体外基因转录产物的分析：基因体外转录时，在反应体系中加入放射性标记的底物。反应后快速提取产物RNA，乙醇沉淀、凝胶电泳后放射自显影分析产物。或生物素标记然后用亲和素辣根过氧化物酶显色系统检测。,2020年5月20日星期三,29,体外转录方法的选择,体外转录的方法有,用不同RNA聚合酶的基因转录体系,原核转录体系,真核转录体系,使用不同DNA模板的转录体系,细胞核抽提物的转录体系,2020年5月20日星期三,30,第二节基因的体外翻译,基因体外翻译的目的和意义,基因的体外翻译是将基因转录产物RNA在离体条件下直接合成蛋白质的过程。,2020年5月20日星期三,31,体外翻译的实验方法主要用于：,1、基因产物的快速确定；,2、基因突变体的快速和分析；,3、蛋白质活性研究；,4、众多基因产物的同时表达；,5、大分子间的相互作用；,6、影响翻译过程的物质检出；,7、表达对细胞有毒性的蛋白和易于被细胞内蛋白酶降解的蛋白和形成不溶包含物的蛋白。,2020年5月20日星期三,32,基因体外翻译的基本原理,基因体外翻译的基本原理是以基因转录产物RNA为模板，在核糖体上进一步生产蛋白质的过程。,基因体外翻译的模板：,1、直接来自体外基因转录实验；,2、细胞内提取的mRNA；,3、通过PCR或RT-PCR产物转录后的RNA。,2020年5月20日星期三,33,利用不同模板和翻译体系进行翻译时，应匹配相应的翻译起始序列。如用原核细胞翻译体系时RNA模板应含有SD序列，应用真核翻译体系时，应有帽子结构；在RNA的3未端含有合适的终止信号。,2020年5月20日星期三,34,基因体外翻译的基本实验流程,体外翻译系统的制备：该系统为基因体外翻译提供必要的条件。,1、核糖体：是蛋白质合成的装配机；,2、环境条件：如离子、翻译过程中所需的各种因子等。,2020年5月20日星期三,35,常用的翻译系统的制备：,1、细胞裂解物的制备,(1)收集一定数量生长良好的细胞，于10ml培养液中，1500rpm离心5min。得细胞沉淀，用0.01mol/LPBS漂洗2次；,2020年5月20日星期三,36,(2)用10倍细胞体积的预冷缓冲液裂解细胞(1%TritonX100，150mmol/LNaCl，10mmol/LTris.HClpH7.4，1mmol/LEDTA，1mmol/LEGTA，pH8.00.2mmol/LPMSF，0.5NP-40)（EGTA：乙二醇二乙醚四乙酸；PMSF：苯甲基磺酰氟；NP-40：壬基酚聚氧乙烯40醚）；,2020年5月20日星期三,37,(3)裂解液4下搅动5min，16000g离心15min后，上清液即为细胞裂解物。,细胞的主要来源：酵母细胞、麦芽组织细胞、兔网织红细胞和Hela细胞。,2020年5月20日星期三,38,2、细胞核糖体的分离：,(1)收集一定数量的成纤维细胞，迅速放于冰上，4600g离心10min，收集细胞沉淀，用预冷的TBS悬浮细胞并洗涤3次。,(2)用2倍体积的TBS-M(10mool/LTris.Cl,pH7.5,10mmol/LKCl和1.5mmol/L乙酸镁)悬浮最后的细胞沉淀，0放置5min，在匀浆器中匀浆1020次。,2020年5月20日星期三,39,(3)每0.9ml匀浆液加0.1ml浓缩的10*TBS-M缓冲液，混合，410000g离心10min。,(4)收集上清提取物，在提取物中加入ATP，GTP磷酸肌酸，肌酸激酶及各种氨基酸。,(5)37培养45min。,(6)室温下10000g离心混合物10min，冷却上清，在4条件下进行SephadexG-25柱层析。收集260nm吸收峰，4165000g离心90min。,2020年5月20日星期三,40,(7)加入饱和的(NH4)2SO4的终浓度为60%，经离心收集沉淀。在含有0.25mol/L蔗糖的TBS缓冲液，悬浮有核糖体的液体放在上层，4216000g离心2.5h。用TBS-M缓冲液洗涤沉淀，悬浮在具有0.25mol/L蔗糖的同一缓冲液中。,(8)用UV光谱仪测A260，确定核糖体浓度。,2020年5月20日星期三,41,基因的体外翻译反应,基因体外翻译一般在2535温度条件下进行，反应体积在40100ul之间，反应体系中主要有：,5或10倍的翻译缓冲液1030ul转录产物，2050ul细胞裂解物或13个A260的核糖体分离物，40100uCi甲硫氨酸，0.2mmol/L蛋白酶抑制剂,2020年5月20日星期三,42,用mRNA模板和进行体外翻译用分离纯化的mRNA为模板，在分离纯化的核糖体上进行蛋白质合成。,优点：可以进行蛋白质合成中的各种影响因子的分析和蛋白质合成速度的比较分析,缺点：分离核糖体的过程比较复杂，反应条件相对严格,2020年5月20日星期三,43,体外蛋白质快速合成体系此方法把体外基因转录和体外蛋白质翻译放在一个体系中进行，即基因转录后直接进行蛋白质翻译的过程。,优点：可以快速检测目的基因在体外的表达情况,缺点：不能对基因转录和蛋白质翻译过程的细节进行分析,2020年5月20日星期三,44,基因翻译产物的分析,凝胶电泳分析翻译过程完成后，用适当的方法终止反应，进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影或液闪的方法进行分析。,放射性核素掺入的百分比分析,2020年5月20日星期三,45,基因体外翻译实验中常遇到的问题,翻译产物的低产率可能原因有,1、RNase的污染2、过量的盐3、mRNA的二级结构4、标记甲硫氨酸的质量不高5、mRNA帽子结构,2020年5月20日星期三,46,有非特异性的电泳带1、不只一种翻译产物，如在真正的起始密码子外还存在其它的起始位点2、翻译产物的降解,