《动物细胞工程》PPT课件.ppt

,常用技术,专题2细胞工程,第二节动物细胞工程,一、动物细胞培养的应用和概念：,动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖.,细胞培养是细胞工程中最基础的技术，是指把有机体的某一组织或器官取出，分散为单个细胞，使其在人工培养基条件下继续生存、生长甚至增殖的过程。,1、动物细胞培养的基本条件,探究活动：,（1）体外培养细胞时需要一些基本的营养物质和生长因子、适宜的酸碱度、渗透压、温度、二氧化碳以及严格的无菌条件。,（2）温热的盐水：可以满足细胞对水分、温度和无机盐的需求，同时，无机盐离子对维持细胞生存所必需的渗透压平衡、离子平衡、PH恒定都起着重要的作用。,血清：可以提供基本的营养物质，如氨基酸、维生素、无机物、脂质、核酸衍生物等。还可以提供激素和各种生长因子，如胰岛素、肾上腺皮质激素、血小板生长因子等。鸡胚浸出液的作用与动物血清类似，含有多种促进细胞生长的营养物质。,1、无菌、无毒的环境培养液和所有培养用具进行无菌处理措施：培养液中加抗生素，定期更换培养液2、营养糖、氨基酸、无机盐、微量元素、促生长因子（维生素、激素等）和动物血清3、温度和PH36.50.57.2-7.44、气体环境O2CO295空气5的CO2,动物细胞培养的条件：,2、动物细胞培养过程：,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官（剪碎）,细胞悬浮液,胰蛋白酶,10代细胞,传代培养,无限传代,单个细胞,加培养液,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。,（分解弹性纤维、胶原蛋白）,动物细胞的培养过程,幼龄动物,取动物器官和组织,剪碎组织,胰蛋白酶处理,细胞培养,单个细胞,动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础,有关概念:,原代培养：直接从机体得到的组织或将其分散成单个细胞后开始的初次培养为原代细胞。（培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代培养）传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。,细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到4050代，这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。,1.蛋白质生物制品的生产2.健康细胞培养培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植3.细胞的生理、药理、病理研究,获得细胞用于检测有毒物质,获得细胞产物，如蛋白质生物制品病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等,3、动物细胞培养技术的应用：,植物组织培养和动物细胞培养的比较,二、动物细胞融合（细胞杂交）,灭活的病毒：仙台病毒疱疹病毒新城鸡瘟病毒,物理法：离心、振动、电激化学法：聚乙二醇,因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。不灭活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。,1、细胞融合：两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程,读下面一段文字资料，思考以下问题：,长期以来，为了获得抗体，采用的是把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体的方法。用这种方法获得的抗体，不仅产量低，而且抗体的特异性差，纯度低，反应不够灵敏。人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的B细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每个B细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的单一抗体，必须用单个B细胞进行无性繁殖，即克隆。,怎样才能获得单克隆抗体？,如何大量生产单克隆抗体？,利用淋巴细胞产生抗体的功能利用肿瘤细胞无限增殖的特性利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞,单克隆抗体,由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。特点：特异性强、灵敏度高,2、单克隆抗体制备过程,细胞融合、筛选,足够数量的、能产生特定抗体的细胞群,单克隆抗体,1、本过程利用了哪些原理？,免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理,2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？,这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体,小结,两个过程,动物细胞培养过程,单克隆抗体制备过程,三个“一”,一个诱导细胞融合的新方法灭活病毒,一个新细胞杂交瘤细胞,一个优势单克隆抗体特异性强、灵敏度高的优势,单克隆抗体的应用,与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显。,1、作为诊断试剂,2、用于治疗疾病和运载药物作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”治疗肿瘤,资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。,植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较,三、动物体细胞移植技术和克隆动物,1、克隆：,2、克隆的条件：,就是无性繁殖，具体地说，是指同一个共同的祖先，通过无性繁殖的方法产生出来的一群遗传特性相同的DNA分子、细胞或个体。如过克隆作动词用，就表示整个无性繁殖的过程。,具有包含物种完整基因组的细胞核的活细胞（如，乳腺上皮细胞）能有效调控细胞核发育的细胞物质（如，去核卵的细胞质）完成胚胎发育的必要的环境条件（如，诱导核-质重组细胞生长、分化的实验条件和怀胎母体的子宫环境）,3、核移植技术与克隆动物：,（2）种类,胚胎细胞核移植,体细胞核移植,易,难,（1）动物体细胞核移植技术将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体用核移植的方法得到的动物称为克隆动物,过程：例1克隆羊培育过程,另一头绵羊的子宫,供体细胞培养,（M卵母细胞）,减数第二次分裂中期,去核的卵母细胞,供体细胞注入去核卵母细胞,受体细胞激活，完成减数分裂、发育,胚胎移植,例2克隆牛培育过程,（3）体细胞核移植技术的应用前景畜牧业、医药卫生以及其他领域有着广泛应用前景,1加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育2保护濒危物种，增加动物的存活数量3可作为生物反应器，生产医用蛋白克隆动物细胞、组织、器官可作为移植的供体了解胚胎发育及衰老过程、做疾病模型等,（4）体细胞核移植技术存在的问题,胚胎移植动物幼体产出概率10克隆动物存在着健康问题克隆动物的食品安全性问题存在争议,具有自我更新和分化发育潜能的原始细胞称为干细胞。这部分细胞未分化或未完全分化，一旦生理需要，它们可以按照一定的途径通过分裂、分化产生机体所需要的细胞。,四、干细胞,（1）概念：,（2）分类：,具有形成机体的任何组织或器官直至形成完整个体的潜能。如受精卵，胚胎干细胞,具有分化成多种组织的潜能，但不能发育成完整个体，如骨髓造血干细胞可以分化出至少12种血细胞。,只能分化成某一类型的细胞，如神经干细胞只能分化为各种神经细胞。,造血干细胞移植：来源：骨髓、动员后的外周血、脐带血治疗：血液系统疾病、遗传性血液病、顽固性自身免疫性疾病、严重免疫缺陷疾病、癌症化疗与放疗后免疫低下等有效手段。胚胎干细胞移植：诱导出各种功能性细胞或相应的干细胞，为部分细胞坏死的病人进行细胞移植，使病人恢复丧失的功能。,（3）应用：,1.动物细胞工程技术的基础是：（）A动物细胞融合B胚胎移植C动物细胞培养D核移植,2.单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（）淋巴细胞小鼠骨髓瘤细胞B淋巴细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞杂交瘤细胞ABCD,C,C,制备单克隆抗体,B淋巴细胞,抗体,细胞融合,灭活病毒,双亲细胞,分泌抗体,无限增殖,原代,传代,50,下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的抗体实验方案,世界上第一只克隆羊“多莉”的培育过程如图所示，请据图回答：,乙,甲,a,b,c,d,e,f,(1)图中的甲为苏格兰绵羊，乙为多莉羊。那么，a和b是通过_分裂形成的，其DNA含量是体细胞的_；c肯定是_细胞，乙的遗传性状与提供_的绵羊一致.,减数,一半,体,细胞核,乙,甲,a,b,c,d,e,f,(2)产生甲和乙的过程分别是和。（3）在形成乙是的过程中，需要将d的细胞核取出，将c细胞核移入d细胞内，此技术叫。所需的受体细胞大多采用动物卵细胞的原因是。（4）绵羊的白色对黑色为显色。若甲是白色绵羊，要判断它是否纯合体，选用与它交配的绵羊最好是。,有性生殖,克隆,核移植,卵细胞大，易于操作；卵细胞具有继续分化的潜能。,黑色,乙,甲,a,b,c,d,e,f,（5）在产生多莉羊时，需将f细胞形成的早期胚胎移入另一头母羊子宫里，这种技术在细胞工程中叫。（6）继植物组织培养后，克隆绵羊的培育成功，证明动物细胞核也有（7）在繁殖多莉羊的过程中，是否遵循孟德尔遗传规律？多莉羊的性状与d羊、c羊及f羊的关系是什么？,胚胎移植,全能性,不遵循，多莉羊的多数性状象c羊，个别性状象d羊，发育也会受到f羊影响。,（07宁夏理综）现有A和B两个肉牛品种，A品种牛的细胞组成可表示为A细胞核、A细胞质，B品种牛则为B细胞核、B细胞质。（1）如果要获得一头克隆牛，使其细胞由A细胞核和B细胞质组成，基本步骤是，从A品种牛体内取出体细胞，进行体外培养。然后再从培养细胞中取出_注入B品种牛的_卵母细胞，经过某处刺激和培养后形成胚胎，该胚胎被称为_，将该胚胎移入代孕母牛的_中，通过培育可达到目的。（2）一般来说，要想大量获得这种克隆牛比较难，原因之一是卵母细胞的数量_，为解决这一问题，可以用_激素处理B品种母牛。（3）克隆牛的产生说明_具有全能性。克隆牛的性状主要表现_品种牛的特征。由A、B两品种杂交得到的牛与克隆牛相比，杂交牛细胞核的遗传物质来自_个亲本，细胞质来自_性亲本，克隆牛和杂交牛的遗传物质组成_（相同，不同）。,细胞核,去核,重组胚胎,子宫,不足,促性腺,动物体细胞核,A,两,雌,不同,（07山东理综）（8分）继哺乳动物乳腺生物反应器研发成功后，膀胱生物反应器的研究也取得了一定进展。最近，科学家培育出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。请回答：（1）将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞，常用方法是。（2）进行基因转移时，通常要将外源基因转入中，原因是。（3）通常采用技术检测外源基因是否插入了小鼠的基因组。（4）在研制膀胱生物反应器时，应使外源基因在小鼠的细胞中特异表达。（5）为使外源基因在后代长期保持，可将转基因小鼠体细胞的转入细胞中构成重组细胞，使其发育成与供体具有相同性状的个体。该技术称为。,显微注射,受精卵（或早期胚胎）,受精卵（或早期胚胎细胞）具有全能性，可使外源基因在相应组织细胞表达,DNA分子杂交（核酸探针）,膀胱上皮,细胞核,去核的卵,核移植（或克隆）,3.植物体细胞杂交技术：（1）过程：,去细胞壁用到的酶：纤维素酶和果胶酶，在以上过程中先后用到哪些技术：细胞融合和植物组织培养。植物体细胞杂交的过程，实际上是不同植物体细胞的原生质体融合的过程。细胞融合完成的标志是新的细胞壁的生成；植物体细胞杂交的结果或目的是获取杂种植株（2）诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电刺激等。化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。（3）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。大大扩展了可用于杂交的亲本组合范围。,2.动物体细胞核移植技术和克隆动物（1）哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植（比较容易）和体细胞核移植（比较难）。（2）选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞比较大，容易操作；卵细胞含有使核内基因全部表达的物质条件和营养条件（3）体细胞核移植的大致过程是：,（4）体细胞核移植技术的应用：加速家畜遗传改良进程，促进良畜群繁育；保护濒危物种，增大存活数量；生产珍贵的医用蛋白；作为异种移植的供体；用于组织器官的移植等。,（5）反对生殖性克隆的原因：严重违反了人类伦理道德,冲击了现有的婚姻、家庭和两性关系等传统的伦理道德观念是在人为地制造心理上和社会地位上都不健全的人克隆技术尚不成熟，可能克隆出有严重生理缺陷的孩子（6）治疗性克隆过程图解：（如右图）运用上述工程克隆的器官在器官移植方面的优点：解决了临床上供体器官不足和器官移植后的免疫排斥反应,3.动物细胞融合（1）动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。（2）动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电刺激等。（3）动物细胞融合最重要的用途是制备单克隆抗体。（3）动物细胞融合的意义：克服了远缘杂交的不亲和性，成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。,（4）动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较：,4.单克隆抗体（1）抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。（2）单克隆抗体的制备过程：,该过程中共有两次筛选：第一次是用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，第二次是为了筛选出产生特定抗体的杂交瘤细胞。体内培养与体外培养相比，其优点是_不需特定的培养基，不需严格的外界环境条件。,（3）杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生专一的抗体。（4）单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。（5）单克隆抗体的作用：作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其它疾病。,