反义RNA的原理及其应用.ppt

反义RNA的原理及其应用实例,制作人：余萍,反义RNA,反义RNAA(antisenseRNA）：一种本身缺乏编码能力，但能与特异靶RNA(主要是mRNA)互补的RNA分子，它可通过配对碱基间氢键作用与靶RNA的特定互补区域结合形成双链复合物，抑制靶RNA的功能，从而调控基因的正常表达。,基本原理,反义RNA技术的基本原理：利用自然存在的或人工合成的反义RNA，通过基因重组技术反向插入到合适的表达载体形成重组DNA，然后转染受体细胞，则这一反插入的序列就会随细胞周期产生大量反义RNA，对基因的表达进行调控，从而抑制、封闭或破坏靶基因的表达。,一、复制水平,DNA复制中的作用反义RNA作为DNA复制的抑制因子，与引物RNA结合或作用于引物前体而抑制DNA复制，从而降低DNA的复制效率。Ecoli的cole1质粒复制的前提是合成适当的RNA(RNA)，它自动折叠后与DNA模板结合形成DNA复制的引物，从复制起始点上游一445bp处开始，以另一DNA为模板反向转录的RNAI正好与RNA1I的结合，阻止了正常引物的产生，从而干扰复制的进行。,作用机制,反义RNA的作用机制主要表现在DNA复制、转录和翻译3个水平上。,二、转录水平,转录及转录后水平的作用反义RNA与mRNA5末端互补结合，阻断帽子结构形成；作用于外显子和内含子的连接区，阻碍前mRNA剪接；作用于polyA形成位点，阻碍mRNA的成熟及其向胞浆转运。在crp基因的ticRNA(transcriptioninhibitorycomplementaryRNA)负向自我调控中，ticRNA与erpmRNA的5端结合，形成类似于RNA聚合酶识别的转录终止信号的二级结构，以反式作用对转录过程本身进行调控J,三、翻译水平,翻译水平的作用反义RNA可直接与mRNA的SD序列(含RBS)或编码区(主要是AUG)结合，从空间上直接阻止核糖体的正常结合或可直接降解靶mRNA。反义RNA与mRNA在SD序列配对形成吻触复合体或在互补区段结合形成RNARNA双链结构，从而调控翻译的进行。在真核生物细胞中有许多RNA在翻译水平上表现反义RNA的功能。如鸡胚胎肌浆中存在的富含U的小分子RNA称为tcRNA，它们可以与肌球蛋白重链的RNA的polyA尾杂交而抑制正常的翻译过程。Audrey等J的研究表明FGFASRNA在翻译过程能有效地抑制FGF一2在哺乳动物细胞中的表达。,反义RNA的重组DNA中只有启动子及终止子，当转染细胞后，重组DNA能自动表达反义RNA，并且重组DNA自身可以整合到宿主的基因组DNA中，或作为“附加体”长期存在。在原核细胞中，反义RNA以针对SD序列效果最好，而在真核细胞中以5端非编码区为标靶最有效。,反义RNA的应用,随着基因组草图的完成,人们研究的重点已转向对基因功能的研究,反义核酸技术无疑为这项宏伟的工程提供了一种有力的工具。,抗病毒作用,病毒是对人和动植物危害极大的病原体,然而对病毒引起的疾病的治疗,目前尚无特效药物与方法。反义RNA却能特异性阻断病毒基因表达和抑制病毒的复制,从而激起许多科学工作者去探索反义RNA治疗病毒性疾病的有效方法。抗病毒反义RNA技术是将特定的病毒基因反向插人到表达险载体中,以构建反义RNA表达载体,再将重组体导人真核细胞(病毒宿主细胞)中表达特异性反义RNA,从而抑制特异有害基因的表达或抑制病毒复制。文献报道,运用反义RNA技术己经成功地抑制疤病毒、流感病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)等对培养的组织细胞的侵袭。用针对植物病毒的反义RNA已培育出具有抗病毒能力的植物。,姚志强等针对不同靶位设计了10段互补反义核酸(DNA片段)，经模型筛选发现针对S基因起始区、SP2增强子帽区和polyA信号编码区的asONs作用最强，揭示反调节基因转录/翻译起始区的反义核酸具有明显的抗病毒作用。Gabor等(1998)使用内源性表达抗HIV一1po1vif和enr基因，以及3LTR序列的反义RNA方案，构建了MuLVLTR启动子逆转录病毒重组质粒，转录CD4淋巴细胞系，结果表明反义RNA能高效地稳定表达，反义envRNA能够最有效地抑制HIV一1的复制，并且反义polRNA使P24抗原减少了1001000倍。另外，国内外在应用反义RNA技术培育抗病(如猪瘟、抗鸡马立克氏病等)动物品系方面也取得比较明显的进展。,反义RNA的抗肿瘤作用,肿瘤的发生是多因素引起的,其中细胞癌基因或/和某些病毒癌基因的异常激活和过度表达是导致细胞恶变的原因之一。如何控制细胞有害基因的表达而在基因水平上治疗恶性肿瘤呢?在目前基因治疗的众多方案中,反义RNA技术是最具吸引力的手段之一。可以设计出针对肿瘤细胞的癌基因、突变基因、非正常表达基因及某些肿瘤相关病毒的癌基因反义RNA,以阻断这些有害基因的表达,达到治疗肿瘤的目的。许多证据表明,反义RNA可使肿瘤细胞的表型逆转,形态变化,增殖速度减慢,生存期缩短,软琼脂中克隆能力下降及体内成瘤能力减弱等,而不影响细胞生存所必需的其它基因的表达。,Trojan等利用EB病毒游离体表达载体克隆胰岛素样生长因子(IGF)反义基因,将此重组体转染大鼠C6细胞系,在大鼠模型上实现了胶质母细胞瘤的基因治疗和预防。我国学者赵晓航等报道互补于Grnyc基因第二外显子及其两侧序列的反义RNA能特异性诱发人食管癌细胞程序性死亡。黄贤明等利用Gets一2、Gmyc和N一ras三个癌基因联合反义RNA能使人肝癌细胞株SMMC7721生长速率下降约70%,软琼脂集落形成能力及裸鼠致瘤能力显著下降,提示针对多个癌基因的联合反义RNA可能给肿瘤基因治疗提供新的途径。,反义RNA技术还可用于肠道疾病(Rotbarteta1，1988)、心血管疾病、B一地中海贫血、调节衰弱心脏中肌细胞的Ca2泵体内平衡u、G蛋白防止高血压、肝纤维化等多种疾病的研究。,参考文献1张西锋，沈伟,潘庆杰,白丁平，耿社民反义RNA技术原理及其在疾病治疗中的应用J.莱阳农学院学报,2004,21(1)：20,21,222.孟博综述，朱大海审校.反义RNA技术的应用与进展J国外医学遗传学分册,2001,24(6)：2923汤郡,张莉,郭辉玉反义RNA技术及其应用J广州医学院学报，1999，27(2)：84,85,谢谢！,