《蛋白质的化学》PPT课件.ppt

第四章蛋白质的化学,蛋白质(protein)是由氨基酸为单位组成的一类重要的生物大分子，是生命的物质基础。,第一节蛋白质的分子组成,第二节蛋白质的分子结构,第三节蛋白质的理化性质及分离纯化,第一节蛋白质的分子组成,蛋白质分子中主要的元素组成是：C、H、O、N、S等。其中N元素的含量相对稳定，约为16%，故每克氮相当于6.25克蛋白质。,一、氨基酸(aminoacid),组成蛋白质的基本单位是氨基酸。如将天然的蛋白质完全水解，最后都可得到约二十种不同的氨基酸。除脯氨酸和甘氨酸外，其余均属于L-氨基酸。,L-氨基酸的结构通式,为了表达蛋白质或多肽结构的需要，氨基酸的名称常常使用三字母的简写符号来表示，有时也用单字母的简写符号来表示，单字母主要用于表示长链多肽的氨基酸顺序。,（一）氨基酸的分类：,从结构通式中可以看出，各种氨基酸的区别就在于侧链R基的不同。组成蛋白质的氨基酸按其-碳原子上侧链R的结构分为20种，20种氨基酸可按R的结构和极性的不同进行分类。,1.根据R基的化学结构，20种常见氨基酸可以分为脂肪族、芳香族和杂环族三类。（1）脂肪族氨基酸含一氨基一羧基的中性氨基酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile含羟基的氨基酸：Ser、Thr含硫的氨基酸：Cys、Met含酰胺基的氨基酸：Asn、Gln含一氨基二羧基的酸性氨基酸：Asp、Glu含二氨基一羧基的碱性氨基酸：Lys、Arg,(2)芳香族氨基酸Phe、Tyr、(Try)(3)杂环族氨基酸His、Pro、(Try),2.根据R基极性来分，20种氨基酸可以分为四类。(1)非极性R基氨基酸Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Met、Pro,(2)不带电荷的极性R基氨基酸R基中含有不解离的极性基团，能与水形成氢键。Ser、Thr、Tyr(OH)Cys(SH)Asn、Gln(酰胺基)Gly的侧链介于极性与非极性之间，有时也把它归为非极性类。(3)带正电荷的R基氨基酸（碱性氨基酸）Lys、Arg、His,(4)带负电荷的R基氨基酸（酸性氨基酸）Asp、Glu,（一）氨基酸的分类：,根据R侧链基团解离性质的不同，可将氨基酸进行分类：1.酸性氨基酸Glu，Asp；侧链基团在中性溶液中解离后带负电荷的氨基酸。2.碱性氨基酸His，Arg，Lys；侧链基团在中性溶液中解离后带正电荷的氨基酸。,3.中性氨基酸侧链基团在中性溶液中不发生解离，因而不带电荷的氨基酸。可分为：,极性氨基酸：Tyr，Cys，Ser，Thr，Asn，Gln，Trp；,非极性氨基酸：Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Phe,Met。,（二）氨基酸的理化性质：,1.物理性质无色结晶，每种氨基酸都有自己特有的结晶形状，可用于鉴定。熔点极高（200以上）。有不同的味道。除胱氨酸、半胱氨酸、酪氨酸外，氨基酸一般都溶于水，但在水中的溶解度差别较大。在稀酸、稀碱中溶解最好。除脯氨酸溶于乙醇、乙醚之外，绝大多数氨基酸都不溶于有机溶剂。所以可用有机溶剂沉淀法生产氨基酸。,2两性解离及等电点：氨基酸分子是一种两性电解质。通过改变溶液的pH可使氨基酸分子的解离状态发生改变。氨基酸分子带有相等正、负电荷时，溶液的pH值称为该氨基酸的等电点（pI）。,氨基酸的解离情况,净电荷+0-正离子两性离子负离子等电点pI,3紫外吸收性质：,组成天然蛋白质分子的20种氨基酸中，只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸对紫外光有光吸收。其吸收峰在280nm左右，以色氨酸吸收最强。可利用此性质采用紫外分分光度法测定蛋白质的含量。,4茚三酮反应：,氨基酸可与茚三酮缩合产生蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm。可利用此性质测定氨基酸的含量。,二、肽(peptide),（一）肽键与肽链：蛋白质是由若干氨基酸的氨基与羧基经脱水缩合而连接起来形成的长链化合物。一个氨基酸分子的-羧基与另一个氨基酸分子的-氨基在适当的条件下经脱水缩合即生成肽。,两氨基酸单位之间的酰胺键，称为肽键。多肽链中的氨基酸单位称为氨基酸残基。多肽链具有方向性，头端为氨基端（N端），尾端为羧基端（C端）。凡氨基酸残基数目在50个以上，且具有特定空间结构的肽称蛋白质；凡氨基酸残基数目在50个以下，且无特定空间结构者称多肽。,（二）生物活性肽：,生物体内具有一定生物学活性的肽类物质称生物活性肽。重要的有谷胱甘肽、神经肽、肽类激素等。,1.谷胱甘肽（GSH）：,全称为-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。其巯基可氧化、还原，故有还原型（GSH）与氧化型（GSSG）两种存在形式。,谷胱甘肽的生理功用：,解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用；参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应；保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态；维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。,2.多肽类激素：,种类较多，生理功能各异。主要见于下丘脑及垂体分泌的激素。,第二节蛋白质的分子结构,蛋白质是由许多氨基酸单位通过肽键连接起来的，具有特定分子结构的高分子化合物。蛋白质的分子结构可人为划分为一、二、三、四级结构。除一级结构外，蛋白质的二、三、四级结构均属于空间结构，即构象。构象是由于有机分子中单键的旋转所形成的。蛋白质的构象通常由非共价键（次级键）来维系。,一、蛋白质分子中的非共价键(次级键),1.氢键：氢键(hydrogenbond)的形成常见于连接在一电负性很强的原子上的氢原子，与另一电负性很强的原子之间。氢键在维系蛋白质的空间结构稳定上起着重要的作用。氢键的键能较低(12kJ/mol)，因而易被破坏。,蛋白质分子中氢键的形成,2.疏水键：非极性物质在含水的极性环境中存在时，会产生一种相互聚集的力，这种力称为疏水键或疏水作用力。蛋白质分子中的许多氨基酸残基侧链也是非极性的，这些非极性的基团在水中也可相互聚集，形成疏水键，如Leu，Ile，Val，Phe，Ala等的侧链基团。,3.离子键（盐键）：离子键(saltbond)是由带正电荷基团与带负电荷基团之间相互吸引而形成的化学键。在近中性环境中，蛋白质分子中的酸性氨基酸残基侧链电离后带负电荷，而碱性氨基酸残基侧链电离后带正电荷，二者之间可形成离子键。,蛋白质分子中离子键的形成,4范德华氏（vanderWaals)引力：原子之间存在的相互作用力。,二、蛋白质的一级结构,蛋白质的一级结构是指蛋白质多肽链中通过肽键连接起来的氨基酸的排列顺序，即多肽链的线状结构。维系蛋白质一级结构的主要化学键为肽键。,胰岛素（Insulin）由51个氨基酸残基组成，分为A、B两条链。A链21个氨基酸残基，B链30个氨基酸残基。A、B两条链之间通过两个二硫键联结在一起，A链另有一个链内二硫键。,蛋白质一级结构的测定,研究蛋白质的一级结构从确定组成蛋白质的单元结构氨基酸算起，已有150年的悠久历史，直到1953年，Sanger首次阐明胰岛素的氨基酸排列顺序，为研究蛋白质的一级结构开辟了道路。这在分子生物学的发展进程中是一个重要突破。目前关于核酸的一级结构研究，由于Sanger等发明了加减法，可以得到了突飞猛进的发展。,蛋白质分子一级结构的研究包括氨基酸的组成、氨基酸的排列顺序、二硫键位置、肽链数目和末端氨基酸种类等等。,样品必需纯（97%以上）；知道蛋白质的分子量；知道蛋白质由几个亚基组成；测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。,测定蛋白质的一级结构的要求,测定蛋白质的一级结构的主要意义：一级结构是研究高级结构的基础。可以从分子水平阐明蛋白质的结构与功能的关系。可以为生物进化理论提供依据可以为人工合成蛋白质提供参考顺序。,在镰刀状红细胞贫血患者中，由于基因突变导致血红蛋白-链第六位氨基酸残基由谷氨酸改变为缬氨酸，血红蛋白的亲水性明显下降，从而发生聚集，使红细胞变为镰刀状。,细胞色素c的一级结构与生物进化的关系,三、蛋白质的二级结构,蛋白质的二级结构是指蛋白质多肽链主链原子局部的空间结构，但不包括与其他肽段的相互关系及侧链构象的内容。维系蛋白质二级结构的主要化学键是氢键。,（一）蛋白质立体结构原则：,1.由于C=O双键中的电子云与N原子上的未共用电子对发生“电子共振”，使肽键具有部分双键的性质，不能自由旋转。2.与肽键相连的六个原子构成刚性平面结构，称为肽单元或肽键平面。但由于-碳原子与其他原子之间均形成单键，因此两相邻的肽键平面可以作相对旋转。,肽键平面由于肽键具有部分双键的性质，使参与肽键构成的六个原子被束缚在同一平面上，这一平面称为肽键平面或肽单元。,（二）蛋白质二级结构的类型：,蛋白质的二级结构主要包括-螺旋，-折迭，-转角及无规卷曲等几种类型。,1.-螺旋：,-螺旋是多肽链的主链原子沿一中心轴盘绕所形成的有规律的螺旋构象，其结构特征为：为一右手螺旋；螺旋每圈包含3.6个氨基酸残基，螺距为5.44埃；螺旋以氢键维系。,影响-螺旋稳定的因素有：极大的侧链基团（存在空间位阻）；连续存在的侧链带有相同电荷的氨基酸残基（同种电荷的互斥效应）；有Pro等亚氨基酸存在（不能形成氢键）。,2.-折迭：,-折迭是由若干肽段或肽链排列起来所形成的扇面状片层构象，其结构特征为：由若干条肽段或肽链平行或反平行排列组成片状结构；主链骨架伸展呈锯齿状；借相邻主链之间的氢键维系。,3.-转角：,-转角是多肽链180回折部分所形成的一种二级结构，其结构特征为：主链骨架本身以大约180回折;回折部分通常由四个氨基酸残基构成;构象依靠第一残基的-CO基与第四残基的-NH基之间形成氢键来维系。,4.无规卷曲：,无规卷曲是指多肽链主链部分形成的无规律的卷曲构象。,在蛋白质分子中，若干具有二级结构的肽段在空间上相互接近，形成具有特殊功能的结构区域，称模序（motif)或超二级结构。,四、蛋白质的三级结构,蛋白质的三级结构是指蛋白质分子或亚基内所有原子的空间排布，也就是一条多肽链的完整的三维结构。维系三级结构的化学键主要是非共价键（次级键），如疏水键、氢键、盐键、范氏引力等，但也有共价键，如二硫键等。,胰岛素分子的三级结构,溶菌酶分子的三级结构,结构域：在一级结构上相距较远的氨基酸残基，通过三级结构的形成，多肽链的弯折，彼此聚集在一起，从而形成一些在功能上相对独立的，结构较为紧凑的区域，称为结构域（domain）。,五、蛋白质的四级结构,蛋白质的四级结构（quaternarystructure)就是指蛋白质分子中亚基的立体排布，亚基间的相互作用与接触部位的布局。亚基(subunit)就是指参与构成蛋白质四级结构的、每条具有三级结构的多肽链。维系蛋白质四级结构的是氢键、盐键、范氏引力、疏水键等非共价键。,亚基的立体排布,蛋白质四级结构与功能的关系变构效应,当血红蛋白的一个亚基与氧分子结合以后，可引起其他亚基的构象发生改变，对氧的亲和力增加，从而导致整个分子的氧结合力迅速增高，使血红蛋白的氧饱和曲线呈“S”形。这种由于蛋白质分子构象改变而导致蛋白质分子功能发生改变的现象称为变构效应。,血红蛋白的氧饱和曲线,血红蛋白的变构,蛋白质的结构层次可总结为:一级结构（肽链结构，指多肽链中的氨基酸排列顺序）二级结构（多肽链主链骨架盘绕折叠形成的有规律性的结构）超二级结构（相邻二级结构的聚集体）结构域（在空间上可明显区分的相对独立的区域性结构）三级结构（球状蛋白质中所有原子在空间的相对位置）四级结构（亚基聚合体）,一、蛋白质一级结构与功能的关系,六、蛋白质的结构与功能的关系,二、蛋白质空间结构与功能的关系,一、蛋白质一级结构与功能的关系一级结构是基础1.一级结构不同,生物功能各异2.一级结构中关键部分相同,生物功能相同3.一级结构中关键部分改变,生物功能改变或丧失,1.酶原的激活,二、蛋白质构象与功能的关系,2.蛋白质前体与活性,3.蛋白质的别（变）构作用：,4.蛋白质变性,生物功能丧失牛胰核糖核酸酶,牛胰岛素的激活,第三节蛋白质的理化性质及分离纯化,一、蛋白质的理化性质（一）蛋白质的两性解离与等电点：由于蛋白质分子中氨基酸残基的侧链上存在游离的氨基和游离的羧基，因此蛋白质与氨基酸一样具有两性解离的性质，因而也具有特定的等电点。,各种蛋白质分子由于所含的碱性氨基酸和酸性氨基酸的数目不同，因而有各自的等电点。凡碱性氨基酸含量较多的蛋白质，等电点就偏碱性，如组蛋白、精蛋白等。反之，凡酸性氨基酸含量较多的蛋白质，等电点就偏酸性。人体体液中许多蛋白质的等电点在pH5.0左右，所以在体液中以负离子形式存在。,（二）蛋白质的胶体性质：,蛋白质分子的颗粒直径已达1100nm，处于胶体颗粒的范围。因此，蛋白质具有亲水溶胶的性质。蛋白质分子表面的水化膜和表面电荷是稳定蛋白质亲水溶胶的两个重要因素。,1.蛋白质表面具有水化层蛋白质分子表面有许多亲水的基团，如-NH2、-COOH、-OH、-SH、-CO-NH-等，在水溶液中能与水分子起水化作用(hydration)，使蛋白质分子表面形成一个水化层。由于水化层的存在，蛋白质颗粒彼此不能接近，因而增加了蛋白质溶液的稳定性，阻碍蛋白质胶粒从溶液中沉淀出来。,2.蛋白质表面具有同性电荷蛋白质表面的可解离基团，在适当的pH条件下，都带有相同的电荷，能与周围电性相反的离子构成稳定的双电层(electricdoublelayer)，使蛋白质颗粒不至于聚集沉淀。,蛋白质颗粒由于水化层与双电层两方面的稳定因素，所以作为胶体系统是相当稳定的，如果破坏了这些因素，蛋白质颗粒会相互聚集而沉淀。,与低分子物质比较，蛋白质分子扩散速度慢，不易透过半透膜，粘度大，在分离提纯蛋白质过程中，我们可利用蛋白质的这一性质，将混有小分子杂质的蛋白质溶液放于半透膜制成的囊内，置于流动水或适宜的缓冲液中，小分子杂质皆易从囊中透出，保留了比较纯化的囊内蛋白质，这种方法称为透析(dialysis)。,（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固：,（1）蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀。稳定因素一旦改变容易沉淀。,（2）蛋白质的变性在某些物理或化学因素的作用下，蛋白质严格的空间结构被破坏（不包括肽键的断裂），从而引起蛋白质若干理化性质和生物学性质的改变，称为蛋白质的变性(denaturation)。,引起蛋白质变性的因素有：物理因素：高温、高压、紫外线、电离辐射、超声波等；化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等。,变性蛋白质的性质改变：物理性质：旋光性改变，溶解度下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等；化学性质：官能团反应性增加，易被蛋白酶水解。生物学性质：原有生物学活性丧失，抗原性改变。,对医药生产应用的意义避免变性在制备有生物活性的酶、蛋白质、激素或其他制品时，要求所需成分不变性，所以应严格控制操作条件，必要时还可以加入保护剂、抑制剂以增强蛋白质的抗变性能力。利用变性细菌蛋白、杂蛋白应变性除去。,核糖核酸酶的变性与复性,（3）凝固,加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝固。变性后的蛋白质由于疏水基团的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白质不一定都是变性后的蛋白质。因此，凡凝固的蛋白质一定发生变性。,二、蛋白质的分离与纯化,（一）盐析与有机溶剂沉淀：1.盐析：在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐析。低盐浓度可使大多数蛋白质溶解度增加，这种现象称为盐溶作用(saltingin)。,常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。,分段盐析：半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白。,2.有机溶剂沉淀蛋白质：凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白质。沉淀原理是：脱水作用；使水的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。,3、重金属盐沉淀蛋白质,蛋白质可以与重金属离子结合成盐沉淀，沉淀的条件以pH稍大于等电点为宜。因为此时蛋白质分子有较多的负离子易与重金属离子结合成盐。重金属沉淀的蛋白质常是变性的。,（二）层析：,层析（chromatography)是一种利用混合物中各组分理化性质的差异，在相互接触的两相（固定相与流动相）之间的分布不同而进行分离分析的技术方法。主要的层析技术有离子交换层析，凝胶层析，吸附层析及亲和层析等。,（三）根据电离性质不同的分离纯化方法,1电泳（electrophonesis）法在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电点状态的蛋白质分子，将各着向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。蛋白质在电场中移动的速度和方向主要取决于蛋白质分子所带电荷的性质、数量以及蛋白质分子的大小和形状，在一定条件下，各种蛋白质的电泳迁移率不同，因而可以达到蛋白质分离的目的。电泳法是分离和分析蛋白质的重要方法。,（四）超速离心：,利用物质密度的不同，经超速离心后，分布于不同的液层而分离。超速离心也可用来测定蛋白质的分子量，蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比。,蛋白质的分离纯化,蛋白质的分离和纯化主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括蛋白质分子的酸碱性质、分子的大小和形状、溶解度、吸附性质和对配体分子的特异亲合力。蛋白质的酸碱性质：蛋白质是两性电解质。在蛋白质分子中，可解离基团主要来自侧链上的功能团，此外还有少数的末端-羧基和-氨基。可以把蛋白质分子看作是一个多价离子，所带电荷的性质和数量是由蛋白质分子中的可解离基团的种类和数目以及溶液的pH所决定的。对某一种蛋白质来说，在某一pH时，它所带的正电荷与负电荷恰好相等，即净电荷为零，这一pH称蛋白质的等电点。蛋白质的等电点在中性盐存在下可发生明显的变化，这是由于蛋白质分子中的可解离基团可与中性盐中的阳离子或阴离子相结合。在没有其他盐类干扰时，蛋白质的质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为蛋白质的等离子点。蛋白质分子的形状：测定蛋白质分子的形状或构象，最精确的方法是X射线晶体结构分析，但这种方法只能测定晶体状态的蛋白质空间结构。对于溶液中的蛋白质分子的形状，只能借助间接的方法来描述蛋白质分子构象的轮廓。,测定蛋白质分子相对质量的方法,根据化学组成测定最低相对分子质量：测定某一微量元素或某一氨基酸的含量如铁原子或色氨酸，并假设蛋白质分子中只有一个铁原子或一个色氨酸，即最低相对分子质量=铁的原子量/铁的百分含量,渗透压法：在半透膜存在时，蛋白质溶液将产生渗透压（平衡时的静水压力）。理想溶液的渗透压与溶质的浓度呈线性相关，其关系可用范托夫公式表示：=cRT/Mr，在高分子溶液中，/c=RT/Mr+Kc，渗透压法简单、准确、且不受蛋白质分子的形状和水化程度影响，但受pH的影响，不能区别溶液中蛋白质分子是否均一。,沉降法：离心力作用,沉降速率法：单位离心场的沉降速度是个定值，称沉降系数s。见P296页,沉降平衡法：沉降产生浓度梯度,凝胶过滤法：标准蛋白质（已知Mr和斯托克半径）和待测蛋白质必须具有相同的分子形状（接近球体），分子形状为线型或与凝胶发生吸附的蛋白质不可用此法测定。,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法：加入SDS和少量巯基乙醇，则电泳迁移率主要取决于其相对分子质量，而与电荷和分子形状无关。,蛋白质的胶体性质：蛋白质溶液属于胶体系统，其具备形成胶体系的条件：分散相（蛋白质分子颗粒）的质点大小在1100nm，能在分散介质中作布朗运动；分散相的质点带同种电荷，不易凝聚成大颗粒而沉淀；分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层如水化层而不易凝聚。蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的，相对的。如果条件改变，则蛋白质就会从溶液中沉淀出来，如改变质点大小、电荷或水化层等。沉淀蛋白质的方法如下：,盐析法：加入大量的中性盐，脱去水化层而沉淀,有机溶剂沉淀法：加入极性的有机溶剂如甲醇等，脱去水化层并增加质点间的相互作用而沉淀,重金属盐沉淀法：当pH大于等电点时，蛋白质颗粒带净负电荷，易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀,生物碱或酸类沉淀法：当pH小于等电点时，蛋白质颗粒带净正电荷，易与生物碱或酸根负离子结合成不溶性盐而沉淀,加热变性沉淀法：蛋白质因加热变性而凝固,蛋白质沉淀法,蛋白质纯化的总目标是增加制品的纯度，即设法除去变性的和不需要的蛋白质以增加单位蛋白质重量中所需蛋白质的含量或生物活性。分离纯化蛋白质的程序为：前处理（细胞或组织处理）、粗分级分离（除去杂蛋白）和细分级分离。,蛋白质的分离纯化方法,分子大小,透析和超过滤：透析指利用蛋白质分子不能通过半透膜而与小分子分离；超滤是利用压力或离心力使小分子溶质通过半透膜而蛋白质被截留在膜上而分离。,密度梯度离心：蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，且每种蛋白质颗粒沉降到与其自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成不同的区带。见P302页。,凝胶过滤：即分子排阻层析。凝胶颗粒内部为多孔的网状结构。大分子最先流出层析柱。,溶解度,等电点沉淀和pH控制,盐溶和盐析：中性盐在低浓度时可增加蛋白质的溶解度，即盐溶。原因是蛋白质分子吸附盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而与水分子相互作用加强；当离子强度增大到足够高时，此时与蛋白质疏水基团接触的自由水被移去以溶剂化盐离子，导致蛋白质疏水基团暴露，使蛋白质因疏水作用凝聚沉淀。,有机溶剂分级分离法：一是降低介质的介电常数，二是与蛋白质争夺水化水。,温度沉淀：温度对溶解度有影响，低温稳定，高温不稳定。在040，大部分的球状蛋白质溶解度随温度升高而增加。,蛋白质分离纯化方法,电荷,电泳（净电荷、分子大小、形状）,区带电泳,聚丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE）,毛细管电泳,离子交换层析,等电聚焦：外加电场时，蛋白质混合物在具有pH梯度的介质中移向并聚焦（停留）在等于其等电点的pH处，形成区带。,层析聚焦：层析柱中建立连续的pH梯度，蛋白质样品由柱上端随缓冲液的展开而聚焦在各自的等电点pH处，形成区段。,吸附：吸附层析，吸附剂（硅石、氧化铝、活性碳）和疏水吸附剂，与待分离分子和杂质分子的吸附与解吸能力不同。,特异亲和力：亲和层析,其它：如高效液相层析（HPLC）,快速蛋白液相层析（FPLC）,蛋白质纯度的鉴定方法：采用物理化学方法如电泳、离心沉降、HPLC和溶解度分析等。纯的蛋白质电泳时，其电泳图谱只呈现一个条带或峰，离心时以单一的沉降速度移动；纯的蛋白质在一定的溶剂系统中具有恒定的溶解度，即溶解度曲线只有一个折点，在折点以前直线斜率为1，在折点以后斜率为零；此外，N-末端分析也用于纯度鉴定（单体蛋白质而言）。必须指出，采用任何单独的一种方法鉴定纯度只能作为蛋白质均一性的必要条件而非充分条件，即蛋白质往往在一种鉴定中表现为均一性，而在另一种鉴定中又表现为不均一性。,蛋白质含量测定与纯度鉴定：测定蛋白质含量的常用方法有：凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法（Lowry法，标准测定方法）、紫外吸收法、染料（考马斯亮蓝）结合法、胶体金法（带负电的疏水胶体，洋红色，遇蛋白质变蓝色，灵敏度最高）,三、氨基酸顺序分析,蛋白质多肽链的氨基酸顺序分析，即蛋白质一级结构的测定，主要包括以下几个步骤：1.分离纯化蛋白质，得到一定量的蛋白质纯品。2.取一定量的样品进行完全水解，再用氨基酸自动分析仪，测定蛋白质的氨基酸组成。,蛋白质的氨基酸组成分析,3.分析蛋白质的N-端和C-端氨基酸。通常采用2,4-二硝基氟苯（DNFB）法和肼解法分别确定蛋白质的N-端和C-端氨基酸残基。,DNFB法分析N-端氨基酸残基,Edman降解法测定氨基酸序列,异硫氰酸苯酯,肼解法分析C-端氨基酸残基,氨基酸自动测序仪,4.采用特异性的酶（如胰蛋白酶）或化学试剂（如溴化氰）将蛋白质裂解成为长短不一的若干条肽段（必须作两套）。,胰蛋白酶（trypsin)的裂解作用,BrCN的裂解作用,将两套不同肽段的氨基酸顺序进行比较，以获得完整的蛋白质分子的氨基酸顺序。,例如，有一个肽段，通过氨基酸组成分析已知其为十肽，假如先以糜蛋白酶水解，则得到一套寡肽，再以胰蛋白酶水解此十肽，得到另一套寡肽。,胰蛋白酶水解AsnTyrArgAlaPheGlyLysTrpHisVal,糜蛋白酶水解ArgTrpGlyLysAsnTyrAlaPheHisVal,AlaPheGlyLysAsnTyrArgTrpHisVal,5二硫键定位,蛋白质分子不经任何处理，直接用酶水解，检出其中二硫键的肽段，然后将二硫键拆开，分别测定两个肽的顺序，将此两肽结构与测出的一级结构比较，就能找出相应的二硫键的位置。,(1)凝胶过滤或离子交换层析：用以分离各肽段，然后用特殊的二硫键显色反应找出含二硫键的肽。,(2)对角线电泳或层析：1966年Brown及Hartlay提出用对角线电泳进行含S-S-肽的定位，此方法是将水解后的肽混合物进行第一相电泳，样品点在中间，电泳毕，将样品纸条剪下，置于装有过甲酸的器皿中，用过甲酸蒸气处理2小时，使-S-S-断裂，此时含-S-S-肽段的静电荷发生了改变。,然后将纸条缝于另一张纸上，进行第二相电泳电泳，电泳条件与第一相相同，只是与第一次方向成直角。在第二相电泳中，那些不含-S-S-的电泳情况与第一相相同，因此电泳后各肽斑均坐落在纸的对角线上，而那些含-S-S-的肽由于被氧化，电荷发生变化，第二相电泳速度就与第一相不同，电泳结果这些肽斑就偏离对角线，肽斑可用茚三酮显示。对角线法由于其速度快，操作简便以及能用于小分子样品，是直接分离-S-S-肽的好方法。,含-S-S-肽被分离后，即可进行肽段顺序分析，并与已测定的该蛋白质的一级结构进行比较，即可找出相应的-S-S-位置。,今后蛋白质一级结构的测定正朝自动化、快速化及微量化发展，关键问题仍然是进一步寻找蛋白裂解和肽分离的方法。蛋白质一级结构的测定不断有新方法和新思路出现，如X衍射法测定一级结构；分离相应蛋白质的mRNA，由mRNA的一级结构排出蛋白质的一级结构等。这些大胆的设想必将有助于蛋白质的一级结构测定，使人们掌握更多的工具和方法去探索生命的奥秘。,蛋白质一级结构的测定,测定多肽链的数目,蛋白质测序的步骤,拆分多肽链,断开多肽链内的二硫键,测定每一肽链的氨基酸组成,鉴定多肽链的N-末端和C-末端,裂解多肽链为较小的肽段,测定各肽段的氨基酸序列,利用重叠肽重建完整多肽链的一级结构,确定二硫键的位置,复习思考题,1.蛋白质有哪些重要的生物学功能？2.蛋白质元素组成的特点？3.组成蛋白质的氨基酸有多少种？如何分类。4.组成蛋白质的氨基酸在结构上有什么共同特点？5.什么是蛋白质的稀有氨基酸和非蛋白质氨基酸？,6.什么是氨基酸的等电点？如何计算？7.什么是肽键、肽单位和多肽链？肽单位和肽有什么特征？8.什么是蛋白质的一级结构？如何测定？9.什么是蛋白质的二级结构？有几种基本类型？-螺旋和-折叠各有何特点？10.什么是超二级结构及结构域？11.什么是蛋白质的三级结构？有何特点？12.维持蛋白质构象的次级键有哪些？,13.什么是蛋白质的四级结构？14.蛋白质的结构和功能之间有什么关系？15.什么是蛋白质的等电点？稳定蛋白质胶体系统的因素是什么？16.蛋白质的盐溶和盐析有何不同？17.什么是蛋白质的变性？哪些因素可引起蛋白质的变性？变性蛋白质的性质发生了哪些变化？18.常用来测定蛋白质含量的方法有几种？其原理是什么？,19.蛋白质分离纯化的方法有哪些？20.为什么说蛋白质的一级结构决定它的空间结构？,