资源描述
饲料添加剂氯化胆碱中氯化胆碱的测定方法,饲料添加剂氯化胆碱中氯化胆碱的测定,氯化胆碱的作用及其在饲料工业中的应用掺假向含量测定方法提出挑战新方法的宗旨、目标、方法的选择和必需解决的关键技术研究与测定条件、实验参数的确定方法的性能检验结论,氯化胆碱的重要作用,氯化胆碱(cholinechloride)，化学名称：2-羟乙基-三甲胺盐酸盐CH3HOCH2CH2NCH3ClCH3根据欧盟动物添加剂标准修订版91/924/EEC，胆碱被列为维生素类化合物（B4），在动物体内，以多种形式起着极其重要的作用：构成卵磷脂和鞘磷脂（构成体内磷脂的7080%）、乙酰胆碱的主要成分-在建立和维持细胞膜结构，促进脂肪代谢、预防脂肪肝，以及大脑和神经组织脉冲传导中起着重要作用，同时作为重要的甲基供体，可促进蛋氨酸转化、机体代谢和动物生长，对于幼小动物尤为重要。天然饲料组分含有一定量的胆碱，但不能满足动物迅速生长的需要。,缺乏氯化胆碱对动物生长的影响,家禽：生长滞缓蛋质量、大小变差孵化率下降禽骨畸形肝肾脂肪堆积、变性行为异常营养不良猪：生长滞缓神经、行为异常脂肪肝繁殖力下降营养不良,牛：生长滞缓行为异常食欲下降小牛呼吸障碍鱼：生长滞缓其他动物（猫、狗和其他皮毛动物）：生长滞缓行为异常皮毛色质变差,氯化胆碱在饲料工业中的应用,氯化胆碱已成为最直接、最经济的补充胆碱的方式，目前已用于各种饲养动物，而且其用量比任何维生素都大，每年世界生产20万吨，90%用做饲料添加剂；随着动物生产的集约化，需求增长大大大于其他维生素。,饲料级氯化胆碱质量标准,饲料级氯化胆碱的种类氯化胆碱水剂:70%75%氯化胆碱粉剂:水剂+赋形剂(玉米芯粉、脱脂米糠、麸皮、稻壳粉和无水硅酸等)50%60%质量标准：HG2941-1999,掺假行为向原国标检测方法提出挑战,HG2941-1999质量要求水剂：7项(含量、PH、乙二醇、总游离氨、灰份、重金属）粉剂：3项（含量、水分、细度）含量测定方法高氯酸非水滴定法银量法基于氯化胆碱中的CL-，并非基于氯化胆碱的特异结构和理化性质，许多廉价无机氯化物和有机盐酸盐如NaCl、NH4Cl、三甲胺氯化物等均可参与和干扰测定。目前掺假现象泛滥的一个重要原因就是利用了现行标准的这一先天缺陷，同时由于粉剂氯化胆碱质量标准的规定项目过少，更是成了掺假行为的重灾区。,其他方法及应对措施,四苯硼钠法欧洲应用较多四苯硼钠法基于有机胺的特性，但易受多种一价阳离子，特别是K+、NH4+等的干扰，如以此法做标准，易步现行标准的后尘。GB/T17481-1998预混料中氯化胆碱的测定雷氏盐法是反应基于有机胺的特性，常见干扰离子少，但比色法很灵敏,测定大含量样品时变异大、精度差。数法并用检测非水滴定法+银量法+定氮法（K氏定氮+直接碱蒸馏），各方法的结果不同说明产品可能掺假，然后用四氯化碳浮选法识别可能的掺杂物，这样做十分烦琐，有的方法存在原理上的问题，无法得到准确的结果和结论。,新方法的宗旨、目标和必需解决的关键技术,宗旨、目标-研制一种能消除当前常见掺假物的影响准确测定氯化胆碱含量，同时又适用于基层简易实验室的常规方法；-研制一种更为科学严谨的可以防范可能出现的其他掺假行为的仲裁方法。方法选择及需解决的关键技术-常规法：拟选雷氏盐法，雷氏盐反应被认为是氯化胆碱的特异反应，干扰少，美国饲料工业协会（NFIA）即用此法测定植物载体粉剂和预混料中的氯化胆碱，但并非全无干扰，有些有机胺（如三甲胺等）有类似的反应，必须在沉淀前予以消除，同时要寻找适当途径克服比色法的缺点。-仲裁法：拟选色谱法，根据氯化胆碱的结构特点，选择适宜的色谱类型（柱）、色谱条件和检测方式。,雷氏盐重量法的研究,测定条件确定1粉剂产品氯化胆碱的提取提取剂和不同温度下的提取效率2可能干扰物(有机胺)的排除a.加碱煮沸效果b.加碱量c.煮沸时间3雷氏盐沉淀a.pHb.沉淀剂用量:见图1c.雷氏盐沉淀的热稳定性,粉剂产品氯化胆碱的提取,提取剂：氯化胆碱属离子型化合物水提取温度表1不同温度的提取效果提取方式温度（）提取效率%振荡室温98.5加热振荡5099.2加热振荡7080100_考虑粉剂载体中均含有一定量的淀粉，其在80糊化，影响以后的过滤和测定，故温度定为703。,2-1可能干扰物的排除,a.加碱煮沸的效果雷氏盐与一般的一价阳离子不反应，但可能与有机胺，特别是三甲胺反应生成类似的红色沉淀。我们翻阅了有关资料发现氯化胆碱作为四级胺它与伯、仲、叔胺的重要区别在于加碱煮沸后，不能变为氨气溢出。我们在实验室找了三甲胺、三乙胺、乙醇胺、盐酸羟胺、苯胺等一些可能与雷氏盐生成沉淀的有机胺，作了实际验证，即加碱煮沸一定时间后，用离子色谱和雷氏盐试剂检测，证明再无有机胺存在。,2-2可能干扰物的排除条件,b.加碱量：从含有0.3000g氯化胆碱和约0.20三甲胺的100mL水溶液中，吸取10.00mL于150mL高脚烧杯中，分别加40%NaOH溶液2、3、4、5mL，边煮沸，边用pH试纸测定，直至无NH3溢出,然后以雷氏盐法测定氯化胆碱的回收率,证明25mL回收率无差异。c.煮沸时间：用同样的方法测定加碱5mL，煮沸3、5、7min的效果，证明去胺效果与测得的氯化胆碱回收率也无差异。为留有一定的保险系数我们将条件定为：加40%NaOH溶液3mL，煮沸5min。,3雷氏盐沉淀,条件pH:我们分别用上述水溶液和以玉米芯为载体的、含有对应量氯化胆碱和三甲胺的样品提取液加碱3mL、煮沸5min，然后分别将溶液pH调至34、56、67和89，证明溶液调至pH89易产生絮状沉淀，雷氏盐沉淀后结果偏高，而调至34结果又有偏低的倾向，故认为将pH调至6左右较合适。沉淀剂用量：我们以操作条件下可能出现的最大氯化胆碱量（0.06g）为前提,分别加入不同体积的2%(m/v)的雷氏盐溶液观察沉淀量结果见图1。,图1沉淀剂的用量,3雷氏盐沉淀,沉淀的热稳定性：我们考察了装有反应沉淀物坩埚滤器在105、不同烘干时间的质量变化，发现烘干2h后即可从沉淀量计算得到化学计量的氯化胆碱含量。而且烘干16h和2h后，沉淀的质量差异均在0.0005g以内,说明在该温度下,氯化胆碱的雷氏盐沉淀物有很好的热稳定性,为雷氏盐重量法测定氯化胆碱建立了重要理论支持。,方法确定的操作程序,称取经105干燥至衡重的试样1g（精确0.0002g）置于100mL容量瓶中+水约70mL70水浴中加热15min震荡10min用水定容过滤吸取10.00mL至150mL高脚烧杯中+40%的NaOH溶液3mL,摇匀,盖一倒置的漏斗电炉上加热,并煮沸5min冷却、加酸调节溶液pH56移入冰水浴冷却至5以下+2%雷氏盐甲醇溶液15mL不时搅拌,反应30min静置陈化1h将沉淀定量转移到已在105烘至衡重并称量过的G4砂芯漏斗中减压抽滤用水洗涤烧杯和沉淀34次105烘干2h，称重。,结果的计算,m2-m1氯化胆碱（%）=100.33045m0式中:m0:试样质量,gm1:空砂芯漏斗质量,gm2:沉淀+砂芯漏斗的质量,g10:稀释倍数0.33045:换算系数(139.63/422.55),方法的性能检验,方法的准确度与精密度线性检验结果见表；添加回收率结果与变异系数见表；与现行国标比较，方法的优越性与HG标准的比较-掺假样品的鉴别见表7与GB/T雷氏盐比色法比较好的精密度见表8方法的适用性不同剂型、不同赋形剂与不同添加量氯化胆碱的添加回收率及测定的变异系数，见表4、5实验室间比对,见表6不同烘干温度测定结果比较，烘干变黑仍可准确测定，见表9,表2雷氏盐重量法的线性检验,氯化胆碱加量三甲胺加量测得氯化胆碱含量050010409.93203021.12302030.14401041.7750051.29y=-0.077+1.0314x,r=0.9996,表3回收率、精密度测定结果-1,剂型添加量测定值相对偏差回收率(载体）%5050.260.16100.5粉剂5050.230.19100.5（玉5051.090.67102.2米5050.290.13100.6芯）5050.230.19100.5平均值%50.42变异系数CV%0.74=同上3029.85(n=5)cv%=2.0299.5109.93(n=7)cv%=6.299.3=,表4回收率、精密度测定结果,剂型添加量测定值相对偏差回收率（载体）%水剂7574.620.5199.57574.780.2899.77574.320.9199.17069.790.3099.77069.440.8099.27069.720.4099.6-平均值%0.5399.5CV%1.0,表5回收率、精密度测定结果-3,氯化胆碱在不同载体市售产品中的添加回收率粉剂氯化胆碱测定次数测定值回收率CV载体总量%n%-稻壳粉60459.5899.30.62麦麸50550.021001.2无水硅酸50550.44100.90.74_,表6实验室间比对试验,氯化胆碱在不同载体市售产品中的添加回收率室间比对粉剂氯化胆碱测定值回收率CV%载体总量121212%-稻壳粉61.8061.1861.7699.099.91.30.7麦麸60.6861.0461.221001010.460.71无水硅酸59.3459.6359.961001010.410.65_,表7雷氏盐重量法和高氯酸非水滴定法的比较,样品编号雷氏盐重量法色谱法高氯酸非水滴定法161.3762.1961.92250.8850.6750.83350.8450.7950.06450.8150.52-550.6649.2552.28645.9146.1652.63746.1244.7749.64811.6911.8450.0599.008.8855.26108.748.3752.98110067.71120023.6,表8雷氏盐重量法和雷氏盐比色法的比较,重复次数重量法比色法_测定次数雷氏盐重量法雷氏盐比色法50.2645.7750.2351.4151.0948.4050.2351.7850.2952.96平均值50.4250.06平均回收率,%100.8100.1CV,%0.745.85_,表9不同烘干条件的氯化胆碱的测定,样品烘干温度和时间测定结果(50%）%_11052h49.61804h49.5721052h50.19804h50.3031052h52.57804h52.36_,小结,本标准法干扰小，可识别掺假样品；方法有很好的准确度与精密度；方法适用于测定不同剂型和不同赋形剂的产品；不受烘干温度的影响；方法简便易行，不需特殊分析仪器，普通饲料厂均可自己控制氯化胆碱的质量。,色谱法,色谱硬件的选择氯化胆碱属离子型化合物在常用的HPLC柱上不保留分子中无任何发色团不能用分光光度法检测选择阳离子交换柱、电导检测器（降低本底加抑制器）色谱条件的确定色谱柱：4mm*250mm，装有羧基/磷酸基弱酸阳离子交换树脂，粒径8.5m柱温：30流动相：17.5mmol/LH2SO4水溶液流速：1mL/min检测器：具抑制器的电导检测器,氯化胆碱、三甲胺盐酸盐和六种常见阳离子标准色谱图,色谱法性能检验-线性,编号玉米芯氯化胆碱上机浓度响应ggmg/Ls*min00.5000010.450.0520.075330.350.1560.239350.250.25100.402070.500.30160.685380.500.40200.870290.500.50251.0872100.500.60301.3020y=-0.02236+0.04423xr=0.9998,色谱法性能检验-准确度、精密度,载体测定次数添加量回收率CVng%玉米芯50.2599.040.55稻壳60.25100.10.93麸皮50.25101.11.25硅胶50.20102.40.81,一些实际样品的测定结果,不同方法测定的12个样品结果见前表7几种典型粉状样品的色谱图15#样品三种方法结果基本吻合，氯化胆碱均约61%62%,色谱图上杂峰少而小。610#样品中有氯化胆碱,但离子色谱和雷氏盐法大大低于高氯酸非水滴定的结果（如8#-Su04前两者测定值11.7%,而后者50%）色谱图上可见,有大的Na+峰和小的三甲胺峰。1112#样品中Na+、NH4+、K+、三甲胺、Ca+2、Mg+2应有尽有，唯独没有氯化胆碱。,1#样品-Hu24,8#粉剂样品-su04,11#样品-Su38,来自马来西亚的验证-1,样品雷氏盐重量法色谱法非水滴定法%151.350.852.2246.944.449.2316.913.452.245.86.056.856.95.854.7624.524.058.4评论:雷氏盐重量法是一种非常适合的测定方法,它对胆碱的选择性高,足以鉴别产品的真假、优劣，方法重现性高，精密度好.,来自马来西亚的验证-2,样品色谱法NaNH4KTMACaMg%mg/kg150.850-1760370600180（0.03）(0.6)(0.06)(0.4)(0.21)244.4-17135-285(4.0)(0.3)313.4540028800270022000650147(3.3)(22.3)(1.0)(5.1)(0.4)(0.2)46.0480001002800-170006500(29.1)(0.1)(1.0)(11.9)(7.5)55.816900-750073000700(10.3)(1.7)(51.5)(0.8)624.01500200-3705300-(25.2)(0.2)(0.08)(3.7),小结,离子色谱从原理上是通过离子所带电荷的多少和离子半径大小将离子分离开来的,所以从科学的角度看，比雷氏盐法更为严密；方法操作简单，快速、灵敏，有很好的准确度和精密度；能有效的识别产品优劣，且能一目了然地指出常见掺入物；能逃过离子色谱的掺假物，必须同时满足；廉价、易得；溶于水；离子态，在规定条件下，有相同的保留时间。,市场最新动向及应对措施,关于乌洛脱品：又名胺仿，化学名六次甲基四胺，它是一种化工原料也可做外用医药。它有中等毒性，不能在饲料中使用。鉴别检验原理：乌洛脱品在酸中分解，分解成甲醛和氨，酸液煮沸，放出甲醛，甲醛可将氨制硝酸银试纸变黑，再加过量的碱，煮沸放出氨，氨可使pH试纸变兰。试剂浓硫酸氨制硝酸银溶液或钠氏试剂：取硝酸银1g，加水20mL溶解，滴加稀氨水（1：2.5）,边加边搅拌,至初显的沉淀将近全溶,过滤,滤液置棕色瓶内,暗处保存。,市场最新动向及应对措施,步骤取粉剂氯化胆碱样品35g,加热水(约6070)50mL,振摇提取,过滤,取约2030mL滤液加浓硫酸1mL,置电炉上加热、煮沸,用沾有氨制硝酸银溶液或钠氏试剂的试纸检验是否有甲醛产生，如产生的蒸汽使滤纸变黑，证明有乌洛脱品存在。处置：一经证明有乌洛脱品存在，即可认定产品搀假，不再进行定量测定。,谢谢,
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