《植物细胞工程制药》PPT课件.ppt

第五章植物细胞工程制药,本章重点：植物细胞培养的基本概念；植物细胞的生理特征；植物细胞培养的基本技术。,第一节基本概念,植物细胞工程涉及很多基本理论和实际操作技术，如组织和细胞培养技术，它是细胞遗传操作及细胞保藏的基础。1.植物细胞的全能性：植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。在适宜条件下，任何一个细胞都可以发育成一个新个体。植物细胞全能性是植物组织培养的理论基础。,易混淆的概念植物的分化：指在个体发育中，相同细胞后代在形态、结构、生理功能上产生稳定性差异的过程。（细胞分裂是细胞分化的基础，生物体的生长发育是细胞分裂和细胞分化共同作用的结果。）脱分化：由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化，或者叫做去分化。再分化:脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根和芽等器官，这个过程叫做再分化。,植物组织培养过程总结,离体的植物器官、组织或细胞（外植体）,愈伤组织,根、芽,植物体,脱分化,再分化,愈伤组织：在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞（细胞排列疏松、无规则）。,补充：愈伤组织的形成,植物组织或器官的无菌培养定义：指在无菌或人工控制条件下（培养基、光照、温度），研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长发育的技术。主要技术有：（1）幼苗及较大植株的培养；（2）从植物体的各种组织、器官等外植体，经脱分化而形成的细胞聚集体的培养；（3）保持良好分散性的单细胞和较小细胞团的液体培养；（4）植物离体器官的培养；（5）未成熟或成熟的胚胎的离体培养。,植物组织培养过程,切取外植体：从活植物体上切下进行培养的那部分组织或器官1）外植体灭菌消毒（根尖、茎、芽、嫩叶、种子、花粉等）2）用消毒过的器械将外植体置于培养皿上3）切取所需的外植体4）将外植体接种于培养容器的培养基上整个试验在超净工作台上进行，保持无菌！外植体经过一段时间在培养基上生长后，会形成愈伤组织,次级代谢产物定义：指生物体生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该生物体无明显生理功能，或并非是生物体生长和繁殖所必需的物质，如抗生素、毒素、激素、色素等。特征：（1）有明显的分类学区域界限；（2）其生物合成需在一定的条件下才能发生；（3）缺乏明确的生理功能；（4）是生命活动的多余成分。,了解内容分生组织培养：指在人工培养基上培养茎端分生组织细胞。外植体:指用于植物组织的培养的器官或组织的切段。突变体：经过证实已发生遗传变异或新的培养物至少是通过一种诱变处理而发生变异所得的新细胞。,思考题,一、名词解释植物细胞的全能性次级代谢外植体突变体愈伤组织二、问答1.什么叫植物组织和器官培养？主要包括哪些技术？2.什么叫次级代谢产物？具有哪些特征？,第三节植物细胞的形态及生理特征,一、植物细胞的形态,二、植物细胞的结构特征,动物细胞,植物细胞,细胞膜细胞核线粒体内质网高尔基体核糖体,中心体,细胞壁,叶绿体,液泡,植物细胞与动物细胞比较,植物细胞由细胞壁和原生质体两个部分组成。原生质体包括细胞质、细胞核和液泡。原始质体包括细胞质和细胞核。与动物细胞和微生物细胞相比，植物细胞有三个特点：具有细胞壁、液泡和质体。,二、植物细胞的主要生理活性物质及其他化学组分,细胞中除含有有生命的原生质体外，还有许多非生命的物质，均为x细胞代谢过程中的产物，一类是生理活性物质，对细胞内生化代谢和生理活动起着调节作用，含量少，但非常重要，另一类是后含物，是贮藏物质或废弃物质，分布于液泡内。1.生理活性物质：对细胞内的生化反应和生理活动起调节作用的物质的总称。包括酶、维生素、植物激素和抗生素。2.后含物：是贮藏物质或废弃物质。包括生物碱、糖苷类、挥发油、有机酸。,三、植物培养细胞的生理特征,一、主要特征：1.细胞个体大（较微生物细胞大得多）抗剪切力差；2.生长速度慢易被微生物污染，培养时需添加抗生素；3.细胞易聚集成团，难进行悬浮培养；4.培养时需供氧，但培养液黏度大，不受强力通风搅拌；5.具有群体效应及解除抑制性；6.细胞培养物滞留与细胞内，产量低；7.细胞具有结构和功能全能性，即细胞可以分化为完整的植株。,二、植物细胞不同生长阶段的特征（了解）1.延迟期：细胞分裂的初始期和最大生长期之间。2.加速期：细胞最大生长期和最大细胞浓度，最佳DNA和蛋白质积累率。3.对数期：介于最大生长率和蛋白质合成完全停止期之间。4.稳定期：细胞数稳定。了解各个时期的特征,思考题,一、填空1.与动物细胞和微生物细胞相比，植物细胞有三个特点：具有、和。2.植物细胞中含有两类代谢产物，一类是，对细胞内生化反应和生理活动起调节作用；另一类是，起贮藏物质或废弃物质的作用。二、问答简述植物细胞的生理特征,第四节植物细胞培养的基本技术,可分为4个阶段：从普通的生长环境中分离植物组织利用无菌技术对所需的植物材料进行无菌处理（以获得清洁的材料）在严格控制的物理和化学环境中对植物材料进行培养和维持将植物组织还原成可以种植的植株,一、植物材料的准备植物组织的选择取决于工作目标，几乎植物的任何部分都能诱导而产生愈伤组织。1.从年轻的植株上取得外植体（避免患病或太老的组织）2.种子也是比较合适的材料之一（种子比柔嫩的植物种子更易于灭菌）,灭菌（填空或选择）常用的灭菌剂有：次氯酸钙、次氯酸钠、氯化汞灭菌步骤（了解)植物材料清洗干净70%酒精浸泡30-60min取出浸入灭菌剂溶液中，15min无菌水清洗3遍（除去消毒剂）-在无菌室或是超净台上进行，以保证在消毒灭菌后不再被污染,二、培养基及其组成,培养基实际上是植物离体器官、组织或细胞等的“无菌土壤”，其特点是营养成分的可调控性。培养基的种类很多，但通常都含有无机盐、碳源、有机氮源、植物生长素、维生素等化学成分。应用最广泛的是MS培养基。,1.无机盐：大量元素（N、P、K、Ca、Mg、S、Cl、Na）+微量元素（Fe、Mn、Zn、Cu、Mo、B）2.碳源：经常使用糖类、肌醇作为碳源，有时也用甘油代替。3.植物生长调节因子：指植物代谢过程中自身形成的植物生长调节剂，在极低浓度时即可调节植物的生长和发育过程，并能从合成部位转运到作用部位而发挥作用。主要有：植物生长素、细胞激动素、赤霉素等,4.有机氮源：多位蛋白质水解产物（如谷氨酰胺）或各种氨基酸。5.维生素：植物自身合成的量不能满足植物细胞的需要，必须加入B族维生素和一定量的生物素和肌醇。,三、培养方法植物细胞的培养方法有很多，但固体培养和液体培养相互配合仍是细胞培养的常规操作。固体培养：在培养基中加入一定量的凝固剂（如琼脂），经加热溶解后，分别装入培养用的容器中，冷却后凝结成固体培养基。,固体培养优点：简便易行、培养所占空间小缺点(1)培养基中营养物质的浓度差导致愈伤组织生长不平衡；（2）气体交换不畅，阻碍了组织呼吸作用的正常进行，堆积有害物质；（3）细胞群体不均匀；（4)培养时需测定一些生理生化指标，此时需转入液体中，会改变组织的形态和生理状态。固体培养最常用的固化剂是：琼脂，最适浓度为0.6%-1.0%,一般培养温度为：（251）需光照，以每天16h为宜。,植物细胞的大规模培养主要分为：1.成批培养：将培养基一次性加入反应器中，接种，培养一定时间后收获细胞的操作方式。最适于植物细胞培养的生物反应器是：气升式反应器。为避免次级代谢产物的大量积累，人们设计了两步培养法，即使用两个生物反应器。第一个用于细胞生物量的积累第二个用于次级代谢产物的生产。日本科学家用此法成功开发了第一个植物细胞工程商品紫草宁,2.半连续培养每隔一天或两天收获一部分培养物（最多可达50%），然后补充等量新鲜培养基。总体积不变。3.连续培养在投料和接种培养一段时间后，以一定速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给新鲜培养基以使细胞生长环境长期维持恒定的方法。该法要维持系统的无菌状态，技术条件比较苛刻。,4.固定化培养（了解）采用的固定化反应器有网状多孔板、尼龙网套和中孔纤维膜等多种类型。优点（1)细胞位置固定，易于获得高密度细胞群体；（2）易于维持细胞间物理化学梯度；（3）有利于细胞组织化；（4）易于控制培养条件及获得较高含量的次级代谢产物。,思考题,一、选择1.植物组织培养过程中，获得外植体后，通常首先要进行灭菌，特别使用于草本植物和柔软组织的灭菌剂是A.次氯酸钙B.次氯酸钠C.氯化汞D.无水乙醇2.植物细胞的培养基中常需要加入无机盐，下列属于大量元素。A.N、S、P、Mg、CuB.N、S、K、Zn、ClC.N、S、Na、Mg、FeD.N、S、P、Ca、Na3、植物细胞培养基中常需要加入维生素。A.A族B.B族C.C族D.D族,4.植物细胞培养中有些研究必须在固体培养基上进行，最常用的固化剂是A.明胶B.淀粉C.琼脂D.硅胶5.最适合植物细胞培养的生物反应器是A.机械搅拌式B.气升式C.转鼓式D.鼓泡塔式6.植物细胞培养应用最广泛的培养基是A.MEM培养基B.DMEN培养基C.BME培养基D.MS培养基二、填空1.植物细胞培养的最适温度是，光照以每天为宜。2.日本科学家成功开发的第一个植物细胞工程商品是。三、名词解释成批培养连续培养,第五节影响植物次级代谢产物积累的因素,在植物组织培养过程中，影响植物次级代谢产物产生和累计的因素有：（1）生物条件：如外植体、季节、休眠等（2)物理条件：如温度、光、通气等（3）化学条件：如无机盐、碳源、维生素等（4）工业培养条件：如培养罐类型、通气等,一、外植体的选择（了解）不同外植体的悬浮细胞，其最大次级代谢的积累时间各异。二、培养条件的影响1.培养环境的内在因素（1）接种和诱导:次级代谢产物的产率与外植体大小、细胞密度及营养成分密切相关。（2）培养基的组成物质基础P：缺乏磷或较低的含磷量都会导致生物量下降或次级代谢产物积累。N：两种主要氮源，即NO3和NH4细胞的生产能力通常取决于NO3和NH4之比。Cu：必要元素,（3）碳源使用最多的碳源是糖类，其影响主要取决于使用的糖类的种类和浓度及其次级代谢产物的生物合成过程。（4）植物生长调节因子在植物细胞培养中起关键性作用。但无规律可循，必须通过反复实验才能确定合适的数量和种类。（5)O2和PH02：维持细胞正常呼吸作用。可通过搅拌和通气进行调节PH:植物细胞生长最适PH为56之间。,（6）渗出物取决于营养条件、发育阶段。2.两步培养法培养基的组成是对细胞生长与次级代谢产物的形成最直接、也是最重要的影响因素。结果显示，生长培养基用于次级代谢产物的生产是非常成功的。但要同时满足最佳生长和最佳次级代谢产物产量则较困难。故提出了两步培养法。,第一步使用适合细胞生长的培养基目的：为实现细胞的高生产率。第二步使用适合次级代谢产物合成的培养基。具有低含量的硝酸盐和磷酸盐，并含有较低的糖分和碳源。,3.培养环境的外部因素（1）温度：最佳温度为2028（2）搅拌频率：产率与发酵罐的搅拌速度有关。（3）培养容器的影响：次级代谢产物的产生与所用培养容器的大小和搅拌装置的不同而不同。（4）光的影响：一个重要因素有关因素：光照时间的长短、光质、光的强度,思考题,一、名词解释两步培养二、填空1.植物细胞培养中使用最多的碳源是。2.植物细胞生长最适温度为。最适PH为。3.光照是植物培养的一个重要影响因素，、对次级代谢产物的累计都有一定的影响。,第六节植物细胞生物反应器,主要有五种类型1.机械搅拌式生物反应器：对搅拌器加以改进。优点：反应器内的温度、pH、溶氧及营养物质浓度较其他反应器更易控制。2.鼓泡塔式生物反应器:通过位于底部的喷嘴及多孔板而实现气体分散。优点：没有运动部件，操作不易染菌，在无机械输入情况下，提供较高的热量和质量传递，适于对剪切力敏感的细胞的培养，放大相对容易缺点：流体流动形式难以确定，混合不匀，缺乏相关数据。,3.气升式生物反应器优点：结构简单，没有泄露点和死角，可以在低剪切力下达到较好的混合和较高的氧传递效果，不易污染，操作费用很低。缺点：高密度培养时混合不够均匀。4.转鼓式生物反应器：通过转动促进反应器内的氧及营养物的混合，设置挡板有助于提高氧的传递，在高密度培养时有高的传氧能力。缺点：难于大规模操作，放大困难。,5.固定化生物反应器:前体是细胞的代谢产物必须分泌到细胞外。优点：可保护细胞免受剪切力；细胞可长时间重复使用易于实现细胞的高密度培养细胞间接触良好，易于分化，有利于次级代谢产物的合成减少细胞的遗传不稳定性易于实现连续化操作,思考题,各种植物细胞培养的生物反应器的特点是什么？,第七章进展与前景,一、诱导子在植物细胞工程研究中的应用二、前体饲喂：是增加次级代谢产率的重要方法三、两相法培养四、转基因技术在次级代谢产物生产中的应用五、植物生物转化技术与生物制药,掌握以下几个名词诱导子：指在植物防御系统内能对抗微生物进攻的某些次级代谢产物。生物转化：指利用生物离体培养细胞或器官及细胞器等对外源化合物进行结构修饰而获得有价值的生理生化反应。,思考题,植物细胞培养有哪些新进展？,