实验1-大肠杆菌的培养与分离45363学习教案

会计学1实验实验(shyn)1-大肠杆菌的培养与分离大肠杆菌的培养与分离45363第一页，共52页。实验(shyn)目的:1.进行大肠杆菌的扩增，利用(lyng)液体培养基进行细菌培养的操作2.进行大肠杆菌的分离,用固体平板培养基进行细菌的划线培养3.说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理第1页/共52页第二页，共52页。特点：结构都相当简单,个体多数(dush)十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.微生物包括哪五类：真菌原生动物 原核生物界 原生生物界真菌界病毒界：是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物(shngw)的总称第2页/共52页第三页，共52页。(二)细菌(xjn)的常识1、结构(jigu)2、分裂(fnli)3、生殖4、变异类型5、在基因工程中的应用第3页/共52页第四页，共52页。大肠杆菌(d chn n jn)第4页/共52页第五页，共52页。大肠杆菌(d chn n jn)属于杆状菌图1-1 常见的三种细菌典型形态A.球菌 B.杆菌 C.弧菌第5页/共52页第六页，共52页。光能自养(z yn)型:光合细菌化能自养(z yn)型:硝化细菌,铁细菌,硫细菌大肠杆菌属于异养兼性厌氧菌第6页/共52页第七页，共52页。细菌(xjn)的革兰氏染色 革兰氏染色法是一种用于细菌的染色法。此法将细菌分为两类，即革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。所谓革兰氏阳性菌就是(jish)用革兰氏染液染色后，再用脱色液处理，细菌仍保留染色液的颜色；革兰氏阴性菌则相反。这两种菌的差别在于细胞壁的成分不同。大肠杆菌(d chn n jn)属于革兰氏阴性菌第7页/共52页第八页，共52页。 培养基 培养基（培养液）是由人工方法(fngf)配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。固体(gt)培养基和液体培养基、半固体(gt)培养基。1.培养基的类型(lixng)(三)细菌的培养成分区别：琼脂第8页/共52页第九页，共52页。2.不同的微生物往往(wngwng)需要采用不同的培养基配方 3.不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、 无机盐、生长因子等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH 、氧气(yngq)、渗透压的要求细菌(xjn)喜荤，霉菌喜素大肠杆菌配方：酵母提取物 0.25g 蛋白胨 0.5g Nacl 0.5g 琼脂 1g 水:50ml第9页/共52页第十页，共52页。4.培养基的用途(yngt)液体培养基：扩增细菌、工业生产固体(gt)培养基：纯化（分离），鉴定、保藏菌种第10页/共52页第十一页，共52页。 菌落(jnlu) 第11页/共52页第十二页，共52页。液体(yt)培养基：表面(biomin)生长均匀混浊(hnzhu)生长沉淀生长第12页/共52页第十三页，共52页。 无菌技术(jsh)1.无菌技术(jsh)的概念 无菌操作(cozu)泛指在培养微生物的操作(cozu)中，所有防止杂菌污染的方法。成功地培养微生物的关键。 第13页/共52页第十四页，共52页。（）消毒(xio d)定义：2.消毒与灭菌的概念(ginin)及两者的区别 （2）灭菌(mi jn)的定义：3.常用的消毒与灭菌的方法是指杀灭大部分病原微生物的方法。 是指杀灭或清除环境中一切微生物（包括芽胞、孢子） 的方法第14页/共52页第十五页，共52页。消毒的方法：1、100煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75 下煮30min或 80 下煮15min3、用75%酒精、新洁尔灭等进行(jnxng)皮肤消毒4、氯气消毒水源5、紫外线消毒第15页/共52页第十六页，共52页。灭菌的方法：1、灼烧灭菌2、干热灭菌：160-170 下加热1-2h。3、高压蒸气(zhn q)灭菌：100kPa、121 下维持15-30min.第16页/共52页第十七页，共52页。1、灼烧(zhu sho)灭菌灭菌(mi jn)的方法：第17页/共52页第十八页，共52页。2、干热灭菌：160-170 下加热1-2h。3、高压(goy)蒸气灭菌：100kPa、121 下维持15-30min.第18页/共52页第十九页，共52页。1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染(wrn)外，还有什么目的？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适(hsh)的方法。（1） 培养细菌用的培养基与培养皿（2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管（3） 实验操作者的双手答：无菌技术还能有效(yuxio)避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。第19页/共52页第二十页，共52页。实验(shyn)用具nLB固体培养基n大肠杆菌菌液（LB液体培养基）n培养皿n接种(jizhng)环n酒精棉n酒精灯n镊子、火柴、记号笔第20页/共52页第二十一页，共52页。第21页/共52页第二十二页，共52页。配制(pizh)培养基包器材(qci)灭菌(mi jn)菌种扩增倒平板接种、划线培养观察记录实验流程第22页/共52页第二十三页，共52页。二、大肠杆菌的培养(piyng)和分离实验操作 （一）培养基的配置(pizh)与灭菌 取2个250ml的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养基和50mlLB固体(gt)培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌15min。LB液体培养基细菌的扩大培养LB固体培养基细菌的划线分离封口膜：既通气又不使菌进入第23页/共52页第二十四页，共52页。 （二）倒平板(pngbn) 灭菌后的培养基在无菌操作台上倒入4个培养皿中，倒后立即置于水平位置上，轻轻晃动(hungdng)，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面第24页/共52页第二十五页，共52页。注意事项：1.培养基灭菌后，需要(xyo)冷却到60 左右时，才能用来倒平板2.灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用酒精棉球消毒 3.操作时右手无名指和小指夹住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培养皿并打开上盖的一边,在酒精灯火焰旁操作.4.需要(xyo)使锥形瓶的瓶口通过火焰，灼烧灭菌5.平板冷凝后，要将平板倒置,既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染.第25页/共52页第二十六页，共52页。 （三）大肠杆菌(d chn n jn)的扩大培养 将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌(mi jn)后的液体培养基中,使其在37摇床培养12小时。注意事项:1.火焰旁从斜面上用(shn yn)接种环取菌;2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧灭菌,冷却后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞复原.第26页/共52页第二十七页，共52页。菌种扩增摇床震荡培养(piyng)12h（于LB液体培养(piyng)基中）本图来自十一学校第27页/共52页第二十八页，共52页。（四）大肠杆菌的划线(hu xin)分离分离(fnl)方法:划线分离(fnl)法和涂布分离(fnl)法第28页/共52页第二十九页，共52页。1、划线(hu xin)分离法无菌操作台上用接种环取菌后在固体培养基的平板上连续划线(hu xin).第29页/共52页第三十页，共52页。不能使用(shyng)脱脂棉，否则容易吸水，造成污染。第30页/共52页第三十一页，共52页。一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。第31页/共52页第三十二页，共52页。第32页/共52页第三十三页，共52页。第33页/共52页第三十四页，共52页。（四）大肠杆菌的划线(hu xin)分离注意事项:1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线(hu xin)多次.2.划线(hu xin)首尾不能相接3.划线(hu xin)后,培养皿倒置培养1224h1、划线(hu xin)分离法第34页/共52页第三十五页，共52页。第35页/共52页第三十六页，共52页。 1.为什么在操作(cozu)的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作(cozu)结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？ 答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端(m dun)，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。第36页/共52页第三十七页，共52页。 2.在灼烧(zhu sho)接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种(jizhng)环温度太高，杀死菌种。 3.在作第二次以及(yj)其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。第37页/共52页第三十八页，共52页。分离后,一个菌体便会形成一个菌落,这是消除污染杂菌的通用(tngyng)方法,也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一第38页/共52页第三十九页，共52页。2、涂布分离法:是指将培养的菌液稀释(xsh)一定的倍数,然后取一定量稀释(xsh)液加在固体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上.第39页/共52页第四十页，共52页。第40页/共52页第四十一页，共52页。划线(hu xin)分离法和涂布分离法哪个更好呢？划线分离：方法简单(jindn)，但单菌落较难分开。涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。第41页/共52页第四十二页，共52页。（五）大肠杆菌(d chn n jn)分离后保存1、临时保藏：接种到固体斜面(ximin)培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。2、长期保存：甘油冷冻管藏法第42页/共52页第四十三页，共52页。1.如何操作才可以(ky)尽量避免被杂菌污染?(1)胆大心细，操作快捷。（2）注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境污染概率。（3）注意微生物生长条件，如PH、渗透压、温度(wnd)等。细菌喜碱，喜蛋白质，喜37度；霉菌喜酸，喜糖，喜25-30度第43页/共52页第四十四页，共52页。2.在培养(piyng)后如何判断是否有杂菌污染?（1）菌落的形态看，是否湿润，透明，粘稠，颜色等。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（2）显微镜观察其形态、大小、看是否有菌丝、孢子、芽孢。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（3）上述方法较难区别同类的不同(b tn)物种，需借助化学和进一步的形态观察，如用革兰氏染色法等。第44页/共52页第四十五页，共52页。3.进行恒温(hngwn)培养时为什么要将培养皿倒置?恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝结成水滴留在盖上；如果正放，则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水扩散，很难再分成单菌落，达不到分离(fnl)目的。第45页/共52页第四十六页，共52页。4.实验完成(wn chng)后,接种过细菌的器皿应如何处理?所有接触过菌的器皿(qmn)都要先高压灭菌后再洗涤（特别是培养基）；使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃第46页/共52页第四十七页，共52页。5.如果(rgu)分离的是转基因的大肠杆菌,如何保证不被普通的大肠杆菌所污染?转基因用的质粒不是细菌中原有的，而是经过改造的，通常(tngchng)加入了抗性基因的DNA序列，所以可用含有相应抗生素的培养基对菌体进行培养。第47页/共52页第四十八页，共52页。【课堂练习】例1关微生物营养物质的叙述(xsh)中，正确的是（ ） A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量D第48页/共52页第四十九页，共52页。例2下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是（ ）A.防止杂菌污染 B.接种(jizhng)前菌种要进行灭菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种(jizhng)前B第49页/共52页第五十页，共52页。编号编号成分成分含量含量粉状硫粉状硫10g10g（NHNH4 4）2 2SOSO4 40.4g0.4gK K2 2HPOHPO4 44.0g4.0gMgSOMgSO4 49.25g9.25gFeSOFeSO4 40.5g0.5gCaClCaCl2 20.5g0.5gH H2 2O O100ml100ml例3右表是某微生物培养基成分，请据此回答：（1）右表培养基可培养的微生物类型(lixng)是 。（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。如不想浪费此培养基，可再加入 .自养(z yn)型微生物 含碳有机物 第50页/共52页第五十一页，共52页。（3）若除去成分，加入（CH2O），该培养基可用于培养 。（4）表中营养成分共有 类。（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是 。（6）右表中各成分重量确定的原则是 。（7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该(ynggi)增加的成分 。固氮( dn)微生物 3 调整(tiozhng)pH 依微生物的生长需要确定 琼脂（或凝固剂） 第51页/共52页第五十二页，共52页。