提取RNA常见问题

提取RNA原理及其常遇到的问题RNA提取一般步骤总结-E/ a% A-RNA提取原理：通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA,再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于 RNA酶无处不在，随时可能将 RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。-M: d9 13 8RNA提取的一般步骤4 e$ s p+ 6 16 m* b所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核 蛋白复合体变性；对内源 RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径：提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下 DNA和蛋白质进入有机相而 RNA留在水相。第一种提取方法将 导致小分子量 RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。实验步骤：?1 i1 U& A% N% A!z破碎组织T分离 RNAt沉淀 RNAt洗涤 RNAt融解 RNAt保存 RNA。1、 破碎组织和灭活 RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS蛋白 酶K等破碎组织，加入 3 -ME可以抑制RNA酶活性。.|# j$ w) s- q5 r52、分离RNA 一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，和蛋白层分开。8 12 T) a | L. a# n3、沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc (pH-5.2)或异丙醇。4、 洗涤RNA使用70%乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。5、融解RNA一般使用TE。6、保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量 RNase的污染，从富含RNase的样品(如胰脏、 肝脏)中分离到的 RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA,对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的 RNA,在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的 RNA,在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量 RNase的降解比小转录 本更敏感。为了增加贮存 RNA样品的稳定性，可以将 RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于 -70C。用于保存 RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的 RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA:加入NaAc至0.3M , 12,000 X g离心5分钟。 氯化锂法提取总 RNA:本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀 RNA,其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA，具有快速简洁的长处，但也存在少量 DNA的污染及RNA得率不高，小RNA片断丢失的缺陷。试验试剂：1、氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3M)尿素、360g(6M)加水至1L,过滤灭菌】：_* 1/ t M+ w8 a# - K N+ c/ a3 C2、悬浮液【10mM? Tris-HCL (pH7.6) ,1mM? EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS% c5 L+ z& ?2 b! y3 z+ t试验步骤：1、 对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入5 10ml氯化锂尿素溶液，匀桨器高速匀桨2分钟；对于少量细胞(107个细胞/ml),则每克组织或细胞加入 0.5ml氯化锂尿 素溶液手工匀桨，并转移至Eppendof管中。2 Y x: p+ S& t S- A2、匀桨液在0 4C放置4小时后，12000g离心30分钟。 L0 O. B7 K x; g- N& - R3、 取沉淀，加入原匀桨液1/2体积的氯化锂尿素溶液，重复步骤2。- k# S& mj3 ) ?3 q( q4、 沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂-尿素溶液复溶后，加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室 温放置15 30分钟并不时摇动混匀，4000g离心5分钟。5、 取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠(pH5.2)及2倍体积的乙醇，20C放置1 小时，5000g离心。6、70%乙醇洗沉淀一次。真空干燥。7、 RNA溶解液溶解沉淀，得 RNA,分装，于70C保存。 植物RNA提取过程中难点的相 应对策! e-酚类化合物的干扰及对策：$ h6 Y2 j0 c* D- k l许多植物组织特别是植物的果实(如苹果、樱桃、李子、葡萄等)和树木类植物中富含酚 类化合物。酚类物质的含量会随着植物的生长而增加。因而从幼嫩的植物材料中更容易提取RNA=此外，针叶类植物的针叶中多酚的含量比在落叶植物的叶子中要高得多。在植物材料 匀浆时，酚类物质会释放出来，氧化后使匀浆液变为褐色，并随氧化程度的增加而加深，这一现象被称为褐化效应(browning effect )。被氧化的酚类化合物(如醌类)能和 RNA稳定 地结合，从而影响 RNA的分离纯化。但 Newbury等发现RNA提取的难易程度和材料中酚类 物质的总量之间并无相关性，因此认为不是所有的酚类化合物都影响RNA的提取。但一般认为所谓的“缩合鞣质”即聚合多羟基黄酮醇类物质(如原花色素类物质)是影响RNA提取的一类化合物。目前去除酚类化合物的一般途径是在提取的初始阶段防止其被氧化，然后再将其和 RNA分开。6 g1 R7 c) ( f& U( k% X防止酚类化合物被氧化的方法:1、还原剂法：一般在提取缓冲液中加入（-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）或半胱氨酸来防止酚类物质被氧化，有时提取液中（-巯基乙醇的浓度可高达 2%。（-巯基乙醇等还可以打断多 酚氧化酶的二硫键而使之失活。Su等认为在过夜沉淀 RNA时加入（-巯基乙醇（终浓度1 %）可以防止在此过程中酚类化合物的氧化。硼氢化钠（NaBH4）是一种可还原醌的还原剂，用它处理后提取缓冲液的褐色可被消减，醌类化合物可被还原成多酚化合物。2、螯合剂法：螯合剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP中的CO N =基有很强的结合多酚化合物的能力，其结合能力随着多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强。原花色素类物质中含有许多芳环上的羟基，因而可以和PVP或不溶性的PVPP形成稳定并可以在以后的抽提步pH8.0以上时PVP结合多PVPP无法去除所有的的复合物，使原花色素类物质不能成为多酚氧化酶的底物而被氧化, 骤中被除去。用PVP去除多酚时pH值是一个重要的影响因素，在 酚的能力会迅速降低11。当原花色素类物质量较大时，单独使用 这类化合物，因而需要和其它方法结合使用。3、Tris-硼酸法：如果提取缓冲液中含有 Tris-硼酸（pH7.5）,其中的硼酸可以和酚类化合物 依*氢键形成复合物，从而抑制了酚类物质的氧化及其和RNA的结合。这一方法十分有效,所以L6 pez-G6 mez等在提取缓冲液中不再加入其它还原剂。但如果Tris-硼酸浓度过高（ 0.2M ）则会影响RNA的回收率。9 O W( V+ A P* Y e:卜 E9 O B2 F$ M4、牛血清白蛋白（BSA）法：原花色素类物质和 BSA间可产生类似于抗原一抗体间的相互 作用，形成可溶性的或不溶性的复合物，减小了原花色素类物质和RNA结合的机会，因此提高了 RNA的产量。BSA和PVPP结合使用提取效果会更好。由于BSA中往往含有 RNase,因而在使用时要加入肝素以抑制RNase的活性。.g2 D# o& D |; Z） z0 S; A/ A5、丙酮法：Schneiderbauer等用-70C的丙酮抽提冷冻研磨后的植物材料，可以有效地从云杉、松树、山毛榉等富含酚类化合物的植物材料中分离到高质量的RNA。% i2 v1 Y4 _; T/ f酚类化合物的去除 ：通过Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以将未被氧化的酚类化合物去除。和PVP、不溶性PVPP或BSA结合的多酚，可以直接通过离心去除掉，或在苯酚、氯仿抽提时除去。Manning利用高浓度的2-丁氧乙醇（50%）来沉淀RNA,而多酚溶解于2-丁氧乙醇 中而被除去。然后用含50% 2-丁氧乙醇的缓冲液洗涤 RNA沉淀以去除残留的多酚。 他认为 即使多酚被氧化，其氧化产物仍可以溶解在高浓度2-丁氧乙醇溶液中而被去除，无需再用NaBH4来处理。多糖的干扰及对策：多糖的污染是提取植物RNA时常遇到的另一个棘手的问题。植物组织中往往富含多糖，而多糖的许多理化性质和RNA很相似，因此很难将它们分开。在去除多糖的同时RNA也被裹携走了，造成 RNA产量的减少；而在沉淀 RNA时，也产生多糖的凝胶状沉淀，这种含有 多糖的RNA沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液。由于多糖可以抑制许多酶的活性， 因此污染了多糖的 RNA样品无法用于进一步的分子生物学研究。在常规的方法中，通过SDS-盐酸胍处理可以部分去除一些多糖；在高浓度Na+或K+离子存在条件下，通过苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖；通过LiCI沉淀RNA也可以将部分多糖留在上清液中。但即使通过这些步骤仍会发现有相当多的多糖和RNA混杂在一起，所以还需要用更有效的方法来解决植物RNA分离纯化时多糖污染的问题。l$ B1 U j用低浓度乙醇沉淀多糖是一个去除多糖效果较好的方法。在RNA提取液或溶液中缓慢加入无水乙醇至终浓度 10%30%，可以使多糖沉淀下来，而 RNA仍保留于溶液中。一般都 是在植物材料的匀浆液中加入乙醇，如Lew in soh n等在从裸子植物的木质茎中提取 RNA时， 在匀浆上清液中加入乙醇至终浓度 10%以沉淀多糖。但 Tesniere等在从葡萄浆果组织中提 取RNA时，是在用CsCl超离心，乙醇沉淀之后的 RNA溶液中加入终浓度 30%乙醇来沉淀多 糖的，进一步纯化了 RNA样品。-h3 6 W3 ） R& L8 F另一个常用的方法是醋酸钾沉淀多糖法。Bahloul等在提取云杉组织的 RNA时在匀浆上清液中加入1/3体积的5M醋酸钾（pH4.8）溶液以沉淀多糖；Ainsworth在提取酸模植物花组织的RNA时加入的是1/5体积的5M醋酸钾（pH4.8）溶液。Hughes等在提取棉花叶和花粉 的RNA时是加1/3体积的8.5M醋酸钾（pH6.5）溶液到匀浆液中以除去多糖等杂质。在提 取某些植物材料的 RNA时，是将上述两种方法结合使用。如L6 pez-G6 mez等在提取芒果中果皮的RNA时，是在匀浆液中加入 0.25体积的无水乙醇和 0.11体积的5M醋酸钾溶液以 去除多糖杂质。Su等在去除褐藻的多糖时，单独使用乙醇或醋酸钾都无效，只有两者结合 使用效果最佳。 & X1 r4 _（ _1 B. BFang等认为缓冲液中含有高浓度的 NaCl有助于去除多糖。Cha ng等在提取松树 RNA时， 缓冲液中NaCl的浓度为2.0M和1.0M，通过氯仿抽提和乙醇沉淀 RNA将RNA和多糖分离。 Manning是将胡萝卜种子等材料苯酚提取后的上清液稀释，调节Na+离子浓度至80mM，然后加入0.4体积的2-丁氧乙醇来沉淀去除多糖。蛋白杂质的影响及对策：蛋白质是污染 RNA样品的又一个重要因素。由于RNase和多酚氧化酶亦属于蛋白质，因而要获得完整的、高质量的RNA就必须有效地去除蛋白杂质。常规的方法是在冷冻的条件下研磨植物材料以抑制 RNase等的活性；提取缓冲液中含有蛋白质变性剂，如苯酚、胍、SDS 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB等，这样在匀浆时可以使蛋白质变性，凝聚；有的方法是 利用蛋白酶K来降解蛋白杂质。进一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白质。Wilcockson利用蛋白质和RNA在高氯酸钠溶液中的溶解度不同将它们分离。在70%高氯酸钠溶液中，RNA的溶解度大于蛋白质的溶解度，因而将大部分蛋白质沉淀下来。接着在离心上清液中加入两倍体积的无水乙醇，这时RNA能沉淀下来而能溶于 70 %高氯酸钠溶液中的残留蛋白质仍然留在上清液中。这样可以除去绝大部分的蛋白质。+ N9 a+ 2 R8 R- Q6 )次级代谢产物的影响及对策：从植物组织中提取高质量RNA的另一个难点是许多高等植物组织尤其是成熟组织能产生某些水溶性的次级代谢产物，这些次级代谢产物很容易和RNA结合并和RNA共同被抽提出来而阻碍具有生物活性的RNA的分离。因不能确定这些次级产物具体是什么物质，所以，目前还没有什么特殊的方法来解决这个问题。Baker等综合Hughes等的选择性沉淀法、Chirgwin的氯化铯梯度离心法和 Iversen等的RNA回收方法纯化了松树种子、成熟松树针叶 等植物组织的 RNA。+ V j- f Z& E由于植物组织特别是高等植物组织细胞内外组成成分的复杂多样性，使得植物组织RNA的提取相对于其它生物材料来说要困难的多。实践中经常会发现，即使同一种植物的不同组织其RNA提取方法会有很大的不同；含有某种干扰因素的不同植物材料，其适用的RNA提取方法可能不同；即使是同一种植物同一种组织材料，但来源于不同基因型植株，其RNA提取方法也可能不一样。所以，对于某一植物或其组织来说，其相应的RNA提取方法必需经过摸索和实践才能确立。7 b# V* i! z$ 5 E随着植物分子生物学研究领域的拓宽，可以肯定地说，在作为其研究基础的植物材料RNA提取过程中还会出现新的难点，但随着不断地探索和经验的积累，科学工作者们一定会迅速地解决这些难点，为植物分子生物学的发展铺平道路。植物RNA提取中的一些特殊方法1d多酚类植物的RNA提取：苹果棉花等多酚类植物提取RNA用TRIZOL一般提不出来。这个方法是验证过有效的，提取的RNA纯度不是特别高,但是用作northern足够。-I# h8 c& N9 i! ?(实验试剂：提取 buffer 200ml: NaCl 1.1688g 100mM Tris 2.4228g 10mM (tris-HCl 8.0)EDTA5.8450g10mM SDS 2.0000g 1% NaOH 调至 8.0,定至 200ml，加 200ulDEPC融解.试验步骤：1、1.5ml离心管用液N2冷冻吼加入0.1g样品，立即加入500ul酚氯仿，再加入500ul提取buffer, 剧烈振荡1-2min,冰上放置5min。 v8 C# N r9 F7 Y2、 4度12000rpm离心15min,上清转入新管，加氯仿异戊醇抽提一次。$ I/ G( ? p2 d6 L% Q;3、取 600ul 异丙醇,-20 度沉淀 20min. s# A6 S- A3 i( d( b( t8 w4、12000rpm 离心 10min。! y& X+ _3 fj; k8 N/5、沉淀用70度乙醇洗。6、 8000rpm 5min。;J _* J. U6 C/- R）7、沉淀晾干，溶于 30UIDEPC水。+ e2 , D5 n2 M* j0 X& r银杏等木本裸子植物的RNA提取方法：5 c6 d & t） 银杏、香机等木本裸子植物，酚类和多糖等次生物质含量较多，对RNA的分离和纯化有很大干扰，严重影响了提取RNA的质量和产量，给相关的分子生物学实验的进行带来阻碍。 目前，RNA的提取方法很多，采取常规的Trizol试剂盒、SDS等方法不能提取银杏 RNA,而Shuju n Cha ng等（1993）的CTAB法，提取RNA质量也较差，降解也十分严重。对其提取步骤 进行改进，得到质量较高的银杏RNA样品。，X7 U7 B5 y/ m9 R, G:试验试剂：1 k6 c- A1 u1 l& h5 R21、 1M tris:1 2.11g T ris，溶于60m L水中，用浓盐酸调至 Ph8 .0，定容至100 mL.用灭菌的 DEPC水溶解。1 v9 Y8 N2 : z3 Q. A& x2 N4 r2、500m M EDTA:1 8.61g E DTA H 20加入 80m L 水中，搅拌溶解，用 NaOH 调 pH 至 8.0，定容至 100mL。3、10 moI/LLiCL: 42.4 gLiCL, 100mL 水溶解即可。4、 提取缓冲液（DEPC水处理）:2% CTAB（蛋白质变性剂）.2% PVPK 30（去除多酚类物质）10 0m M Tris-HCL （Ph8.0）25 m M EDTA金属鳌合剂）2.0 M NaCL（去除多糖和 CTAB 配法:2 g CTAB,2 g PVP10 mL 1 moI/L tris, 5mL 500 mM EDTA, 11.7gNaCL,定容到 100mL。; a* & r i. W+ k9 z5、 亚精胺（提取时加少量）（RNA酶抑制剂）6、4%0 一疏基乙醇（提取时加）（去除多酚类 物质）8 O. C3 o, z6 t& 2 u7、氯仿异戊醇（24: 1）（抽提蛋白质）8、 10 MLiCL （沉淀大分子 RNA）# u0 H1 P% i! g1 Q5 m# G:9、SSTE（溶解 RNA）1.0 M NaCL 0. 5%SDS 1m MEDTA（PH8.0） 10 m MTrisHCL（pH8 ）配 法:2.9 g NaCL, 0.25 g SDS, 0.5 mL 1 M tris, 100 u L 500 mM EDTA, pH8.0定容至 50 mL。5 z5 d（ 2 B1 q$ U（ g, d5 9试验准备：-W W1 d% x$ f51、研钵和玻璃器皿用锡纸包好，200 C以上向温烘烤2小时以上，或180*C高温烘烤4小时。2、 塑料制品（枪头和离心管）最好用新的，并且用报纸包好，121C高压灭菌，灭菌40 min , 或连续两次121C高压灭菌，每次灭菌 20 min，然后用烘箱烘千。X b% # 1 b/;3、 所有溶液配制好后，加 DEPC水使DEPC uJ浓度为0.1%, 37 C过夜，1211C高压灭菌40 min.（其中Tris因为不能用DEPC处理，所以Tris用DEPC处理的水溶液灭菌后配制。）试验步 骤：